細(xì)胞凋亡的檢測方法

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1、細(xì)胞凋亡的檢測方法細(xì)胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細(xì)胞凋亡形式，根據(jù)死亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的差別，可以將二者區(qū)別開來。細(xì)胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹幾種常用的測定方法。1、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測：根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)學(xué)特征，人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。a、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡觀察：未染色凋亡細(xì)胞體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落；染色凋亡細(xì)胞常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分

2、割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。b、熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡：一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況，常用的DNA特異性染料有：有HO33342（Hoechst33342）,HO33258(Hoechst33258),DAPI。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲存用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度一般為2-5ug/ml。DAPI為半通透性，用常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲存液用蒸餾水溶解為濃度1mg/ml，使

3、用終濃度一般為0.5-1ug/ml。結(jié)果評判：細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased）,部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。c、透射電子顯微鏡觀察。結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)。細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。2、磷脂酰絲氨酸外翻分析：磷脂酰絲氨酸（Phosphatidyllse

4、rine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35-36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（propidineiodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將An

5、nexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的及死細(xì)胞區(qū)分開來。方法：a、懸浮細(xì)胞的染色：Ⅰ、將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（0.5×106）用PBS洗2次，加入200μlBindingBuffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V(20ug/ml)10μl及PI(50ug/ml)5μl,室溫避光30min,加入400μlPBS，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測（一般不超過1小時），同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。Ⅱ、貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)

6、胞。Ⅲ、爬片細(xì)胞染色：同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果及注意事項(xiàng)：整個操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞；操作時注意避光，反應(yīng)完畢后盡快在一個小時內(nèi)檢測；3、線粒體膜勢能（△ψmt）的檢測：多種細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)不同的細(xì)胞凋亡時，皆發(fā)生線粒體跨膜電位△ψmt的下降，并且發(fā)現(xiàn)△ψmt下降是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，在細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）之前，還發(fā)現(xiàn)一量線粒體△ψmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine123、3,3-Dihe

7、xyloxacarbocyanineodide[DiOC6(3)]echloro-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodide[JC-1]、Tetramethylrhodaminemethylester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。方法：將正常培養(yǎng)的細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加入使用終濃度為Rhodamine123(1μM)終濃度為DiOC6(25μM),JC-1(1μM),TMRM(100μM),37℃平衡30min,流式細(xì)胞計(jì)檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)

8、度。結(jié)果及注意事項(xiàng)：始終保持平衡染液中PH值的一致性，因?yàn)镻H值的變化將影響膜電位。與染料達(dá)到平衡的細(xì)胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結(jié)合，降低染料的濃度，引起假去極化。4、DNA片斷化檢測：細(xì)胞凋亡時主要生物化學(xué)特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色