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1、基因槍轉(zhuǎn)化法獲得草地早熟禾（Poa中國生物工程雜志ChinaBiotechnology,2006,26(8):10～14基因槍轉(zhuǎn)化法獲得草地早熟禾(PoapratensisL.)轉(zhuǎn)基因植株信金娜韓烈保劉君韓秀賓(北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所北京100083)摘要將與植物抗旱耐鹽有關(guān)的BADH—CMO雙基因,CMO單基因,DREB1A單基因三種外源基因利用基因槍法分別轟擊草地早熟禾的胚性愈傷組織,在附加lOOmg/L潮霉素的繼代培養(yǎng)基篩選和附加50mg/L潮霉素的再生培養(yǎng)基中壯苗1個月,將抗性植株移栽到花
2、盆中.經(jīng)過PCR檢測,Southern雜交分析,證明BADH—CMO雙基因,CMO基因,DREB1A基因已經(jīng)成功整合到草地早熟禾的植物基因組中.關(guān)鍵詞草地早熟禾BADH—CMO雙基因DREB1A基因CMO基因中圖分類號:Q789DREB1A轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個與植物干旱,高鹽及低溫有關(guān)的功能基因的表達,利用轉(zhuǎn)錄因子來改良植物抗逆性,能獲得較為理想的綜合效果,DREB1A轉(zhuǎn)錄因子目前已經(jīng)成功地用于小麥的遺傳轉(zhuǎn)化.甜菜堿是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的滲透保護劑.高等植物中,甜菜堿的生物合成經(jīng)由膽堿一甜菜堿
3、醛一甜菜堿兩步反應(yīng)完成,其中第一步反應(yīng),由膽堿單氧化物酶(CMO)催化,第二步是在甜菜堿醛脫氫酶(BADH)的催化下將甜菜堿醛轉(zhuǎn)化為甜菜堿.采用BADH,CMO單個基因?qū)χ参镛D(zhuǎn)化已有報道.如沈義國等獲得耐1.2%NaC1鹽濃度的轉(zhuǎn)CMO基因煙草植株,張艷敏等獲得了耐鹽耐旱性顯著提高的轉(zhuǎn)BADH基因的小麥植株.草地早熟禾是我國北方廣泛應(yīng)用的草坪草種,以往對草地早熟禾遺傳轉(zhuǎn)化多為抗除草劑,報告基因轉(zhuǎn)化等方面的研究,對草地早熟禾進行功能基因轉(zhuǎn)化的較少.本試驗首次運用本實驗室構(gòu)建的BADH—CMO雙基因?qū)?/p>
4、草地早熟禾進行轉(zhuǎn)化,以期獲得較高的抗旱,耐鹽性狀.同時也把CMO單基因,DREB1A單基因表達載體轉(zhuǎn)化到草地早熟禾愈傷組織中,獲得了草地早熟禾的轉(zhuǎn)基因植株.收稿日期:2006-05-22修回13期:2006-07-31國家轉(zhuǎn)基因植物研究與產(chǎn)業(yè)化專項項目(J2002一B-006)資助,國家"863"計劃資助項目(2001AA244082),教育部"新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃"資助項目}}通訊作者,電子信箱:hanlb@tom.net1材料和方法1.1植物材料供試草地早熟禾品種有:"Baron","Mar
5、dona","Midnight",采用成熟種子為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織,誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為P2:MS+2,4一D(1ing/L)+6-BA(0.1mg/L)+CuSO(3mg/L)+酸水解酪蛋白CH(1g/L),KM:MS+2,4-D(2mg/L)+6-BA(0.2mg/L)+CuSO4(3mg/L)+CH(1g/L),P5:MS+2,4-D(2mg/L)+6一BA(0mg/L)+CuSO4(3mg/L)+CH(1g/L)[7i,再生培養(yǎng)基為AK2:MS+KT(0.2rag/L)+6-BA(1mg/
6、L),KBN:MS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)+NAA(0.5mg/L),AL2:MS+6-BA(1mg/L)+LH(0.5g/L).經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的胚性愈傷組織作為基因槍轉(zhuǎn)化的靶材料.1.2表達載體DREB1A基因的表達載體為pCAMBIA1301,包含DREB1A和Gus基因,分別由ubi及CaMV35S啟動子驅(qū)動,篩選基因為hpt(圖1).BADH—CMO雙基因表達載體為pCAMBIA1303,包含BADH和CMO基因,分別由ubi及CaMV35S啟動子驅(qū)動,
7、篩選基因為hpt(圖2);CMO基因表達載體為pCAMBIA1303,包含CMO和Gus基因,分別由曲i及CaMV35S啟動子驅(qū)動,篩選基因為hpt(圖3).這些表達載體均由北京林業(yè)大學(xué)草坪草實驗室構(gòu)建并保存.2006,26(8)信金娜等:基因槍轉(zhuǎn)化法獲得草地早熟禾(P0.pm把L)轉(zhuǎn)基因植株11其中DREB1A基因序列長為650bp,BADH基因序列長為1500bp,CMO基因序列長為1300bp.hpt35SDREBIAUbi35SGIl圖1DREB1A基因表達載體結(jié)構(gòu)圖Fig.1Struct
8、ureofDREB1Aexpression圖2BADH—CMO雙基因表達載體結(jié)構(gòu)圖Fig.2StructureofBADH—CMOdoubleexpression圖3CMO表達載體結(jié)構(gòu)圖Fig.3StructureofCMOexpression1.3基因槍轉(zhuǎn)化方法采用美國Bio.Rad公司的PDS一1000/He型基因槍,具體操作方法參照說明書.具體采用的參數(shù)為:采用Ca(NO3)2+PEG4000包被質(zhì)粒DNA;使用1m金粉作為質(zhì)粒DNA的載體;選擇打槍高度6cm,轟擊1次,無滲
