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1、基因槍介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化苧麻獲得轉(zhuǎn)基因植株的研究作物雜志Crops2010.1基因槍介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化苧麻獲得轉(zhuǎn)基因植株的研究宮本賀熊和平馬雄風(fēng)喻春明王延周(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所,農(nóng)業(yè)部麻類遺傳改良與工程微生物重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,410205,湖南長沙;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所,455000,河南安陽)摘要以苧麻品種中苧1號子葉愈傷組織為受體材料,利用基因槍法將外源雙價(jià)抗蟲基因(Cry-+吖)導(dǎo)入苧麻,以期建立基因槍轉(zhuǎn)化苧麻的技術(shù)體系.結(jié)果表明,基因槍轉(zhuǎn)化苧麻的最佳條件為轟擊壓力1300psi,金粉+DNA用量500~g+1.0槍,轟擊距離9cm,轟擊次數(shù)2次,共獲得4株陽性轉(zhuǎn)基
2、因植株.苧麻子葉愈傷組織的基因槍轉(zhuǎn)化法是苧麻遺傳轉(zhuǎn)化的新方法,為建立苧麻基因槍轉(zhuǎn)化體系奠定了基礎(chǔ).關(guān)鍵詞苧麻;基因槍;子葉;愈傷組織苧麻(BoehmerianiveaL.)屬蕁麻科(Urticace.ae)苧麻屬(Boehmeria)宿根性多年生草本植物,原產(chǎn)于我國,是優(yōu)良的韌皮纖維作物,在世界素有"中國草"的美譽(yù),是我國目前僅次于棉花的重要紡織纖維,也是重要植物蛋白飼料資源和新型生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)材料.苧麻生長期間,鞘翅目和鱗翅目害蟲多,造成的損失嚴(yán)重,噴施農(nóng)藥不僅會使害蟲產(chǎn)生抗藥性,而且會殺死天敵和污染環(huán)境¨.通過傳統(tǒng)育種方法,苧麻產(chǎn)量有了很大的提高,但常規(guī)育種
3、在進(jìn)一步提高產(chǎn)量,品質(zhì)和抗性等方面的局限性已逐步顯現(xiàn),基因工程手段的逐步應(yīng)用為苧麻育種提供了新途徑.國內(nèi)外相繼有苧麻轉(zhuǎn)基因研究成功的報(bào)道,這些研究大多利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將外源基因轉(zhuǎn)入苧麻.基因槍轉(zhuǎn)化法沒有宿主范圍限制,靶受體類型廣泛,是繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)法之后應(yīng)用最廣泛的一項(xiàng)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù).目前,抗蟲基因工程應(yīng)用最多的是Bt殺蟲晶體蛋白基因和蛋白酶抑制劑基因,已獲得的抗蟲轉(zhuǎn)基因作物有棉花,煙草,水稻,玉米,小麥,大豆,馬鈴薯,油菜等.本試驗(yàn)利用基因槍法對雙價(jià)抗蟲基因(CrylA+丌)導(dǎo)人苧麻作者簡介:宮本賀,碩士研究生,研究方向?yàn)槠r麻基因工程熊和平為通訊作者,博士生導(dǎo)師
4、,研究方向?yàn)槠r麻遺傳育種基金項(xiàng)目:國家"十一五"支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BADo6B03)和農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(nyhyzx07—018)收稿日期:2009—09—24;修回日期:2009—10—22愈傷組織進(jìn)行研究,對影響基因槍轟擊轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行了探索,為建立有效,較為完善的苧麻基因槍轉(zhuǎn)化體系提供理論依據(jù),為最終培育出兼抗鞘翅目和鱗翅目害蟲的苧麻種質(zhì)材料奠定基礎(chǔ).1材料與方法1.1材料植物材料:供試苧麻品種為中苧1號,來源于國家種質(zhì)長沙苧麻圃.表達(dá)載體:攜帶有雙價(jià)抗蟲基因(CrylA+")及報(bào)告基因的植物表達(dá)載體pGBI4ABC由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)
5、所郭三堆研究員提供(圖1).大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株為DH5a.圖1pGBI4ABC表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖1.2質(zhì)粒提取和PCR擴(kuò)增參照質(zhì)粒提取試劑盒(購自Tiangen公司)說明書進(jìn)行.引物由上海生工合成,CrylA基因擴(kuò)增引物為Btl5-CCTCTTCTAACTTGCCCTCCGC一3.Bt25.CACCCACGATG1TI'ACCGAGTG-3;T/基因擴(kuò)增引物為Cptil5-GArrITGAAGCACCTCGGAAG-3,Cpti25.cTcATcATcrITrcATcccTGc.3.擴(kuò)增反應(yīng)體系如下:基因組DNA(1g/1)5primer(
6、20ng/tx1)3primer(20ng/Ix1)1l0.5Ixl0.5Ixl872010.1作物雜志CropsdNTP(10mMeach)10xTaqBufferTaq酶(5U/u1)MgC12Total0.5LLl2.5l0.4LLl2l25&1擴(kuò)增條件:CrylA基因?yàn)?5oC5rain,95℃1min,52oC1min,72oC1min,36個(gè)循環(huán),72℃延伸10min;CpTI基因?yàn)?5℃5rain,95qC1rain,53℃1rain,72oC1min,36個(gè)循環(huán),72℃延伸10rain.1.3子葉愈傷組織培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化成熟子葉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基
7、為MS+0.25mg/L6一BA+0.12mg/LIAA+3%葡萄糖,愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+0.01mg/LTDZ+0.12mg/LIAA+0.12mg/LGA+3%葡萄糖,再生芽生根培養(yǎng)基為MS+0.46mg/LNAA+3%蔗糖.金粉的準(zhǔn)備與DNA的包被參照J(rèn)iang等的方法.將培養(yǎng)1個(gè)月的疏松的子葉愈傷組織在含0.5mol/L甘露醇的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行高滲處理10～24h,用基因槍(Bio.Rad1000/He)進(jìn)行轟擊.轟擊壓力設(shè)置900psi,1100psi和1300psi,金粉及質(zhì)粒DNA用量設(shè)置4個(gè)組合:1000~g+0.5g,1000~g+1.0g
8、,500~
