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1、Survivin基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在cos-7中的表達(dá)作者：李紅 李明紅 楊樺 鐔旭民【摘要】 ?。勰康模菘寺∪藄urvivin基因并在真核細(xì)胞中表達(dá)。［方法］以人喉癌組織中提取總RNA為模版，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈RT-PCR法獲得survivincDNA。將該基因克隆到pcDNA3.0載體中,構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.0/survivin，將測序正確的survivin基因通過脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染cos-7，Westernblot檢測survivin蛋白在cos-7中表達(dá)。［結(jié)果］DNA測序證明獲得了
2、survivin基因，其序列與GeneBank中報(bào)道序列完全一致。Westernblot檢測survivin蛋白獲得高效表達(dá)，其相對分子質(zhì)量為16.5kD。［結(jié)論］Survivin基因的克隆和表達(dá)均獲得了成功，為進(jìn)一步探討survivin基因在喉癌診治中應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】survivin基因 人喉癌組織 基因表達(dá) ConstructionofSurvivinEukaryoticExpressionVectorandItsExpressionincos-7Abstract:［Purpose］Toclon
3、eandexpresshumansurvivingene10witheukaryoticvector.［Methods］TotalmRNAwasextractedfromhumanlaryngealcancertissue,andthenthefull-lengthsurvivincDNAwasobtainedbyRT-PCR.ThesurivingenewasclonedintopcDNA3.0vectorandthepcDNA3.0/survivinvectorwasconstructedandtransf
4、ectedintocos-7cells.Thesurvivinproteinwasanalyzedbywesternblot.［Results］ThecDNAofsurvivinwassequencedandconsistentwiththesequencereportedinGenebankwithblast。Westernblotanalysisdemonstratedthatthesurvivinproteinwasexpressedandtherelativedmolecularmasswasabout
5、16.5kD.［Conclusions］survivingenehasbeenclonedandexpressedsuccessfullyandcanbeusedforfurtherstudytheapplicationsofsurvivinondiagnosisandtherapyinthelaryngealcancer.Keywords:survivingene;eukaryoticexpression;vectorconstructionSurvivin是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(inhibitorofa
6、poptosis10proteins，IAP)家族的成員，其功能主要通過抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻斷細(xì)胞凋亡過程。該蛋白選擇性地表達(dá)于胚胎發(fā)育組織和人類大多數(shù)腫瘤組織，而正常成人終末組織中不表達(dá)，其獨(dú)特的分布特點(diǎn)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用已受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。為了進(jìn)一步探討該基因在人喉癌組織中的表達(dá)及其在喉癌診斷及預(yù)后判斷中的作用，我們構(gòu)建了survivin基因的真核表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞以觀察該基因在其中的表達(dá)情況，為下一步喉癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)。1材料與
7、方法1.1材料 人新鮮喉癌組織、pcDNA3.0質(zhì)粒和猴成纖維細(xì)胞cos-7細(xì)胞系及DH5α菌株均為本科保存。限制性內(nèi)切酶及胰蛋白酶購于寶生物工程(大連)有限公司；T4DNA連接酶、DNA純化試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega公司，用于組織總RNA提取的TripureIsolationReagent提取試劑盒購于Gibco公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineReagent2000和G418購于Gibco公司，survivin兔抗人多克隆抗體購自于Santacruz公司。1.2方法1.2.1PCR引物設(shè)計(jì)
8、 根據(jù)GeneBank中survivin序列，設(shè)計(jì)一對引物，10P1(survivin基因上游引物，5′GCCGGTACCATGGGTGCCCCGACG；3′P2(survivin基因下游引物，5′GCCCTCGAGTCAATCCATGGCAGC3′。在上游和下游引物5′端分別加入了BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，以便于克隆。引物由上海博亞生物有限公司合成。1.2.2目的基因surviv
