HBVX基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建研究

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1、HBVX基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建研究【關(guān)鍵詞】,,HBV;真核表達(dá)載體;pCDNA3.1摘要目的:構(gòu)建HBVX基因與pCDNA3.1相融合的高效真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究HBVX基因的功能奠定基礎(chǔ)。方法:設(shè)計(jì)并合成HBVX基因的引物，從HBVDNA陽性的血清中，PCR擴(kuò)增得到HBVX基因全序列，將其連接到真核表達(dá)載體pCDNA3.1上后，酶切圖譜分析PCR檢測(cè)和擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析等，鑒定所構(gòu)建的真核表達(dá)載體。結(jié)果:以重組載體為模板擴(kuò)增得到的片段大小與已知HBVX基因大小相同，酶切也得到目的基因片段，測(cè)序結(jié)果也顯示與已知X基因序列相同。結(jié)論

2、:成功構(gòu)建了HBVX基因的真核表達(dá)載體，為下一步研究HBVX基因及其產(chǎn)物的功能奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞HBV;真核表達(dá)載體;pCDNA3.1乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）與原發(fā)性肝細(xì)胞癌（PrimaryHepatocellularCarcinoma，PHCC）密切相關(guān)，呈全球流行，嚴(yán)重威脅人類健康［1，2］。至今，HBV的致癌機(jī)制仍不清楚。近年來發(fā)現(xiàn)，HBVX基因的編碼蛋白HBVX蛋白（HBxAg）被認(rèn)為在慢性HBV感染發(fā)展成HCC中起重要作用，可以在多個(gè)環(huán)節(jié)影響HCC形成和發(fā)展。我們構(gòu)建了X基因的表達(dá)載體，為了深入

3、系統(tǒng)地研究HBV7X基因?qū)υl(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生的影響及其作用機(jī)制和發(fā)展針對(duì)該基因的抗HBV及抗肝癌技術(shù)奠定實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)?！?材料和方法　1.1材料HBVDNA陽性血清樣本來自我院門診和住院病人。1.2主要試劑Trireagent液購自Promega公司;γTaqDNApolymerase，限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI購自華美生物工程公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天為時(shí)代科技有限公司;質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒購自TaKaRa公司;質(zhì)粒pCDNA3.1+和大腸桿菌DH5α購自博士德生物技術(shù)公司?！?.3方法1.3.1X基因產(chǎn)物的

4、制備:從GeneBank獲取HBVX基因全序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性X基因擴(kuò)增的引物，正義引物為5'CATGGTACCATG-GCTGCTAGGCTGTG3'，反義引物為5'CGT-GAATTCTGCATGGTGCTGGTGA3'，下劃線部分為KpnI和EcoR7I酶切位點(diǎn)。該引物定義全長(zhǎng)約500bp左右的X基因。選取HBVDNA陽性的患者血清，用Trireagent液裂解后，用25∶24∶1（v∶v∶v）的酚/氯仿/異戊醇抽提和乙醇沉淀純化HBVDNA。PCR采用94°C預(yù)變性5min，94°C變性1min，53°C退火1min，72°C

5、延伸1min，30次循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。用DNA回收試劑盒回收DNA。1.3.2質(zhì)粒構(gòu)建，按參考文獻(xiàn)［3］進(jìn)行:將回收的X基因和pCDNA3.1+載體分別經(jīng)KpnI和EcoRI雙酶切后，用T4DNA連接酶將兩者的酶切產(chǎn)物連接。常規(guī)技術(shù)制備感受態(tài)DH5α大腸桿菌，構(gòu)建好的表達(dá)X基因的真核表達(dá)載體，命名為pCDNA3.1-X，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌中。擴(kuò)增，保存。1.3.3真核表達(dá)載體的鑒定:以重組的真核表達(dá)載體為模扳，進(jìn)行PCR鑒定（條件同前）;用KpnI和EcoRI雙酶酶切重組的真核表達(dá)載體，電泳進(jìn)行鑒定;從轉(zhuǎn)

6、化的大腸肝菌提取質(zhì)粒DNA，電泳鑒定。將重組的真核表達(dá)載體測(cè)序鑒定。2結(jié)果　重組真核表達(dá)載體pCDNA3.1-X的鑒定?！?.17以重組表達(dá)載體pCDNA3.1-X為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得500bp左右的片段，與所選取的GeneBank中已知的X基因大小相符合，見圖1?！?.2從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定得到大約為6kb的特異性片段，即重組質(zhì)粒已經(jīng)成功的轉(zhuǎn)化大腸桿菌，見圖2。測(cè)序結(jié)果顯示與已知基因一致。3討論HBV被認(rèn)為是原發(fā)性肝癌發(fā)生的高危因素之一，尤其是HBVX基因。已經(jīng)證明其編碼產(chǎn)生的X蛋白與HCC的

7、發(fā)生密切相關(guān)，但是至今，X基因的致病機(jī)制仍不清楚，因此有必要針對(duì)X基因與HCC的關(guān)系做進(jìn)一步的研究，對(duì)阻斷X基因表達(dá)的方法和效果進(jìn)行探討。X基因是HBV最小的基因開放讀碼框，定位于1376-1850核苷酸之間，HBVX基因序列是HBV基因內(nèi)功能重疊最明顯的區(qū)域。HBVX基因的編碼產(chǎn)物HBVX蛋白（HBx蛋白或HBxAg），是由約154個(gè)氨基酸殘基組成的大小為16.5kD的功能蛋白，它不僅存在于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核中也可以檢測(cè)出［2］，由此可以推斷X蛋白在細(xì)胞遺傳物質(zhì)的產(chǎn)生過程中起著重要作用。7近年來在對(duì)HCC的研究中發(fā)現(xiàn)，HBx蛋白的作

8、用不可忽視。目前已知X蛋白具有反式激活的作用。HBxAg不僅可以激活HBV增強(qiáng)子，核心啟動(dòng)子，S基因啟動(dòng)子等所有HBV的啟動(dòng)子，還能激活猴病毒（SV40）早期啟動(dòng)子，人類免疫缺陷病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列（HIVLTR），單純皰