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1、人突變p27基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞凋亡的影響作者:徐少勇,陳珺,熊玲,王家寧,黃永章【摘要】目的探討人突變p27基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。方法構(gòu)建重組腺病毒Adp27mt,轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞SW480,用流式細(xì)胞儀、DNA片段分析法、TUNEL法觀察Adp27mt對大腸癌細(xì)胞的凋亡的誘導(dǎo)作用。結(jié)果成功構(gòu)建了Adp27mt,在感染復(fù)數(shù)≥50時,可達(dá)100%的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。Adp27mt轉(zhuǎn)染SW480。24h后流式細(xì)胞儀檢測在G1期前出現(xiàn)了亞二倍體凋亡峰,細(xì)胞DNA提取電泳后出現(xiàn)了凋亡特征性梯帶,TUNEL法檢測凋亡指數(shù)實驗組和對照組分別為(82.0±3.2)和(5.0±3.5),差異有顯著性(
2、P<0.01)。結(jié)論人突變p27基因能有效誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞的凋亡?!娟P(guān)鍵詞】大腸癌;p27mt基因;細(xì)胞凋亡基金項目:湖北省自然科學(xué)基金資助項目1.DepartmentofGastroenterology,ReminHospital;YunyangMedicalcollege,HubeiShiyan442000,China,2.InstituteofClinicalMedicineAbstract:ObjectiveTostudytheinducingeffectofhumanmutantp27geneonapoptosisofthecolorectalcancercells.Metho
3、dsTherecombinantAdenovirusAdp27mtwas11constructedtoinfectthecolorectalcancercellSW480.TheinducingeffectofAdp27mtonapoptosisofthecolorectalcancerwasmeasuredbytheflowcytometer,theDNAfragmentanalysisandTUNELmethod.ResultsAdp27mtwassuccessfullyconstructed.Ifthemultiplicityofinfection(MOI)was≥50,thei
4、nfectionefficiencycanreach100%.After24hofinfection,therewasanapoptotichypodiploidpeakontheflowcytometerbeforeG1andtherewereapoptoticcharacteristicbandsintheDNAelectrophoresis.TheapoptoticindexdetectedbyTUNELmethodwas82.6±3.2(Adp27mtgroup)and5.0±3.5(controlgroup)respectively,thedifferenceofwhichwas
5、significant(P<0.01).ConclusionHumanmutantp27genecaneffectivelyinduceapoptosisofthecolorectalcancercells.Keywords:Colorectalcarcinoma;p27mtgene;Apoptosis細(xì)胞周期調(diào)控的失常與腫瘤的形成密切相關(guān)。p27是一種多功能細(xì)胞周期素依賴激酶抑制因子(cyclindependentkinase11inhibitor,CDKI),主要通過阻止細(xì)胞周期G0/G1期至S期的轉(zhuǎn)換,實現(xiàn)對細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控,進(jìn)而阻止細(xì)胞的增殖和腫瘤的形成[1,2]。本研究構(gòu)建
6、了重組p27mt的E1區(qū)缺失的復(fù)制缺陷性腺病毒,用以轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞株SW480,觀察其在細(xì)胞中的表達(dá)及對SW480細(xì)胞周期、凋亡的影響。旨在探討大腸癌治療的新途徑。1資料與方法1.1主要試劑人p27mt重組腺病毒(Adhp27mt)由本科構(gòu)建[3]。LacZ重組腺病毒(AdLacZ)由王家寧博士構(gòu)建[4],鼠抗人p27kip1多克隆抗體為SantaCruz公司產(chǎn)品,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG單克隆抗體購自北京中山公司。SW480購自武漢大學(xué)典型物保藏中心。Westernblot檢測試劑盒為美國KPL公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1大腸癌細(xì)胞SW480的培養(yǎng)100ml/LFCS、RPM
7、I1640培養(yǎng)基37℃、50ml/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞鋪至70%~80%時用于實驗。1.2.2Xgal的化學(xué)染色11取15cm培養(yǎng)瓶中可用于實驗的SW480細(xì)胞,按20、40、50、100的感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,MOI)轉(zhuǎn)染AdLacZ48h后,經(jīng)5ml/L戊二醛固定15min,PBS洗3次后,加Xgal染液染色,37℃50ml/LCO2培養(yǎng)箱中孵化4~24h