人突變p27基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞凋亡的影響

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1、人突變p27基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞凋亡的影響:徐少勇,陳珺,熊玲,王家寧,黃永章【摘要】目的探討人突變p27基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。方法構(gòu)建重組腺病毒Adp27mt,轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞Sedicalcollege,HubeiShiyan442000,China,2.InstituteofClinicalMedicineAbstract:ObjectiveTostudytheinducingeffectofhumanmutantp27geneonapoptosisofthecolorectalcanc

2、ercells.MethodsTherebinantAdenovirusAdp27mttonapoptosisofthecolorectalcancereasuredbythefloeter,theDNAfragmentanalysisandTUNELmethod.ResultsAdp27mtultiplicityofinfection(MOI)eterbeforeG1andthereethodtgroup)and5.0±3.5(controlgroup)respectively,thediff

3、erenceofanmutantp27genecaneffectivelyinduceapoptosisofthecolorectalcancercells.Keya;p27mtgene;Apoptosis細(xì)胞周期調(diào)控的失常與腫瘤的形成密切相關(guān)。p27是一種多功能細(xì)胞周期素依賴激酶抑制因子(cyclindependentkinaseinhibitor,CDKI),主要通過阻止細(xì)胞周期G0/G1期至S期的轉(zhuǎn)換,實現(xiàn)對細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控,進(jìn)而阻止細(xì)胞的增殖和腫瘤的形成[1,2]。本研究構(gòu)建了重組p27m

4、t的E1區(qū)缺失的復(fù)制缺陷性腺病毒,用以轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞株SI1640培養(yǎng)基37℃、50ml/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞鋪至70%~80%時用于實驗。1.2.2Xgal的化學(xué)染色取15cm培養(yǎng)瓶中可用于實驗的SOI)轉(zhuǎn)染AdLacZ48h后,經(jīng)5ml/L戊二醛固定15min,PBS洗3次后,加Xgal染液染色,37℃50ml/LCO2培養(yǎng)箱中孵化4~24h顯微鏡下觀察藍(lán)染細(xì)胞(即LacZ基因表達(dá)的陽性細(xì)胞),分別計算藍(lán)染細(xì)胞的百分率。1.2.3p27mt基因表達(dá)的檢測取75cm培養(yǎng)瓶中用于實驗的

5、SOI100)和AdLacZ(MOI100)轉(zhuǎn)染。同樣條件下48h后,分別將細(xì)胞用0.5g/L胰蛋白酶消化,收集細(xì)胞,PBS洗2次。1×SDSPAGE細(xì)胞裂解液500μl裂解后,煮沸5min,離心取上清,行OI100)轉(zhuǎn)染SLPR200μl混勻,室溫避光3min后加入DNAPREPstain1000μl染色試劑(PI染色)混勻,15min后,在CounterEpicsXL流式細(xì)胞儀上檢測,分析細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。設(shè)AdLacZ組(MOI100)和空白對照組(不加病毒正常培養(yǎng)的SOI≥50時,

6、感染率為100%,表明重組腺病毒在體外能有效地介導(dǎo)基因向SOI:100)感染24h后收集細(xì)胞,用1×SDS×PAGE裂解液裂解細(xì)胞后100℃煮沸5min,離心取上清,用美國KPL公司的TMB系統(tǒng)B染色后,Adp27mt轉(zhuǎn)染的細(xì)胞呈高表達(dá),而AdLacZ和正常對照組僅有微量(內(nèi)源性)27KD的蛋白質(zhì)表達(dá),說明本實驗所構(gòu)建的人突變p27重組腺病毒在St轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞①:非感染的Sarker;2:空白對照組;3:AdlacZ組;4,5:Adp27mt組圖3DNA片段分析檢測細(xì)胞凋亡2.5TU

7、NEL法檢測細(xì)胞凋亡凋亡細(xì)胞核呈濃染,深褐色,胞漿濃縮,體積變小。Adp27mt組與空白對照組凋亡指數(shù)分別為(82.6±3.2)%及(5.0±3.5)%,經(jīng)檢驗有顯著性意義(P<0.05),說明Adp27mt能明顯誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞的凋亡,見圖4。2.6外源性p27mt對細(xì)胞周期的影響S,AdachiK,etal.Roleofthephosphatidylinositol3'kinaseAktsignalpathanpancreaticductalcarcinomacelllines[J]

8、.Pancreas,2004,28(3):353358.[6]GuoyeloidLeukemiaFactor1inhibitserythropoietininduceddifferentiation,cellcycleexitandp27(Kip1)accumulation[J].Oncogene,2004,20(3):780793.

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