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《畢赤酵母表達研究進展》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、利用強效可調(diào)控啟動子AOX1，已高效表達了HBsAg、TNF、EGF、破傷風毒素C片段、基因工程抗體等多種外源基因［11、12、13］，證實該系統(tǒng)為高效、實用、簡便，以提高表達量并保持產(chǎn)物生物學活性為突出特征的外源基因表達系統(tǒng)，而且非常適宜擴大為工業(yè)規(guī)模［14］11.彭毅，楊希才，康良儀。影響甲醇酵母外源蛋白表達的因素。生物技術通報2000，4：33-3612.113CreggJM.TschoppJFStillmanC,etal.High-levelexpressionandefficientassemblyofhepatitisBsurfaceantigeninthemethylotro
2、phicyeastpichia.pastorisBio/Technology,1987,5:479-48513.SreekrishmaK,NellesL，PotenzR，etal.High-levelexpression,purification,andcharacterizationofrecombinanthumantumornecrosisfactorsynthesizedandcharacterizationinthemethylotrophicyeastpichia.pastoris,Biochemistry,1989,28:4117-412514.SiegelRS,Buckho
3、lzRG,ThillGP,etal.Productionofepidergrowthfactorinmethylotrophicyeastcells,InternationalPatentApplication,1990,PublicationNo:WO90/10697畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母，可利用甲醇作為其唯一碳源。甲醇代謝的第一步是：醇氧化酶利用氧分子將甲醇氧化為甲醛，還有過氧化氫。為避免過氧化氫的毒性，甲醛代謝主要在一個特殊的細胞器－過氧化物酶體－里進行，使得有毒的副產(chǎn)物遠離細胞其余組分。由于醇氧化酶與O2的結(jié)合率較低，因而畢赤酵母代償性地產(chǎn)生大量的酶。而調(diào)控產(chǎn)生醇過氧化物酶的啟動
4、子也正是驅(qū)動外源基因在畢赤酵母中表達的啟動子。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)是目前最優(yōu)秀、應用最廣泛的外源基因表達系統(tǒng)之一，它不但克服了大腸桿菌表達系統(tǒng)不能表達結(jié)構(gòu)復雜的蛋白質(zhì)、表達的蛋白多形成不溶性包涵體、背景蛋白多、表達產(chǎn)量低等缺陷，彌補了哺乳類細胞、昆蟲細胞表達系統(tǒng)操作復雜、表達水平低、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)造價昂貴的不足，還具有其他酵母表達系統(tǒng)無法比擬的優(yōu)越之處。該表達系統(tǒng)具有強有力的醇氧化酶基因啟動子，可嚴格調(diào)控外源蛋白的表達；同時作為真核表達系統(tǒng)，可對表達的蛋白進行翻譯后的加工與修飾，從而使表達出的蛋白具有生物活性。此外，該酵母菌營養(yǎng)要求低、生長快、培養(yǎng)基廉價，易于進行操作和培養(yǎng)；其高密度發(fā)酵技術
5、業(yè)已成熟，便于工業(yè)化生產(chǎn)；表達量高，許多蛋白可達到每升克級以上水平；表達的外源蛋白可分泌到胞外，分泌的內(nèi)源蛋白少，外源蛋白分離純化簡便；外源基因通過質(zhì)粒整合到基因組上，基因工程菌株遺傳穩(wěn)定性好；胞內(nèi)表達蛋白的分選和區(qū)域化，增加了表達蛋白的穩(wěn)定性，減少表達產(chǎn)物對宿主菌的毒害作用；糖基化程度低，與釀酒酵母相比，巴斯德畢赤酵母不產(chǎn)生過度的糖基化；所分泌的糖蛋白的免疫原性較低，更利于臨床應用。2畢赤酵母表達宿主菌畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母的一種，能在甲醇為惟一碳源的培養(yǎng)基上生長。甲醇能誘導其表達甲醇代謝所需的酶,如AOX、二羥丙酮合成酶（NDHAS）和過氧化氫酶（catalase）,表達的C)b和c
6、+C%的含量甚至可達到總細胞蛋白的60%-80%。而以葡萄糖、甘油或乙醇為碳源時，AOX幾乎不表達。AOX的合成是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的，其基因啟動子為誘導型。目前主要有3種表達宿主菌,它們之間的區(qū)別在于AOX1個或2個基因的缺失，而造成對甲醇利用能力高低的變化。據(jù)甲醇利用能力的改變,可將畢赤酵母分成三種表現(xiàn)型。SMD1168和GS115菌株含有AOX1基因,這種菌株能快速利用甲醇作為碳源和能源,能在甲醇培養(yǎng)基中以野生型速率生長,因此稱為甲醇快利用型菌株(Mut+);KM71菌株雖不含有AOX1基因,但含有AOX2基因,AOX2基因與AOX1基因同源性92%,其編碼的蛋白與AOX1基因編碼的蛋白
7、有97%同源性,能緩慢利用甲醇,這類菌株為甲醇慢利用型菌株(Muts);MC100-3菌株因AOX1和AOX2同時缺失,不能在甲醇培養(yǎng)基中生長,這類菌株為甲醇不利用型(Mut-)。三種表型菌株在AOXl啟動子調(diào)控下均可誘導外源蛋白的表達。各種畢赤酵母表達菌株(表1)均來自于對野生菌株NR-RL-Y11430的改良。SMD1168、SMD1165和SMD1163菌株為蛋白酶缺陷型菌株,這類菌株基因組中缺失編碼蛋白酶A(pe
