reck在人喉鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義

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1、RECK在人喉鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義【摘要】目的通過檢測80例人喉鱗癌組織中RECK的表達(dá)情況，討探RECK在喉鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法用免疫組化法、蛋白印跡分析(Westernblot)技術(shù)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測在喉鱗癌組織標(biāo)本中RECK的表達(dá)。結(jié)果RECK蛋白在正常喉組織及喉鱗癌組織的大片癌巢中不表達(dá)，僅在角化珠中和粘膜固有層中的混合腺的腺細(xì)胞有表達(dá)。結(jié)論本研究提示RECK基因在喉癌的發(fā)生發(fā)展中不起關(guān)鍵作用。【關(guān)鍵詞】喉鱗癌;RECK基因Abstract:Objectiv

2、eTodiscussthepotentialroleofRECKinLaryngealsquamouscellcarcinoma(LSCC)bytestingtheexpressionofRECKinhumanLSCC,atotalof80LSCCpatients.Methods(1)RECKexpressioninsurgicallyresectedtissuesamplesoflaryngealcarcinomas(n=80)wereexaminedimmunohistochemically;(2)

3、TheexpressionsofRECKwasevaluatedbyWesternblotandReversetranscriptionpolymerasechainreactions(RT-PCR).ResultsThepositiveRECKstainedinthehornypearlandglandulartubecells,butnotinthecarcinomalcells.ConclusionsRECKgenecantbeconsideredasakeypointinthepathogen

4、esisofLSCC.10　　Keywords:Laryngealsquamouscellcarcinoma(LSCC);RECKgene　　喉癌是頭頸部第二位原發(fā)于上皮的最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于鼻咽癌。在過去40年里對喉癌的發(fā)病機(jī)理的研究已取得許多進(jìn)步，但喉癌發(fā)生的確切機(jī)理、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制還不十分清楚。RECK(reversion-inducing-cysteine-richproteinwithkazalmotifs)基因是近年來發(fā)現(xiàn)的新型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑[1]，目前研究認(rèn)為作為一種

5、獨(dú)立的膜錨合基質(zhì)金屬蛋白酶調(diào)節(jié)因子，RECK基因在多種正常組織中均高表達(dá)，而在腫瘤組織中表達(dá)量明顯下降甚至不表達(dá)，且RECK基因表達(dá)下降的幅度與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力成明顯正相關(guān)。因此，RECK基因是目前研究較為廣泛的一種抑癌基因?！　?材料與方法　　1.1臨床資料　　喉癌組織80例,來源于2005年5月至2007年10月遼寧省腫瘤醫(yī)院行喉癌手術(shù)的切除標(biāo)本,患者年齡42～81歲,平均60.5歲,均保存有完整的臨床和病理資料:I期24例，II期12例，III期22例，IV期1710例。每1例石蠟切片皆包括癌組織

6、和其癌旁的正常黏膜組織?！　?.2免疫組化染色　　山羊抗人多克隆抗體RECK(1∶50倍稀釋)購自SantaCruzBiotech，免疫組化SP試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。所有組織均經(jīng)甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，免疫組化SP法染色參照試劑說明書進(jìn)行，RECK采用高溫高壓法修復(fù)抗原。用已知的陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。　　1.3Westernblot法檢測組織中RECK蛋白表達(dá)　　應(yīng)用RIPA裂解液裂解組織,應(yīng)用分光光度計(jì)測定總蛋白濃度SDS-PAGE凝膠電泳(90V,2h),電轉(zhuǎn)儀

7、電轉(zhuǎn),(300mA,1.5h,4℃)。將硝酸纖維素膜與適當(dāng)稀釋的第一抗體(1∶200)室溫下反應(yīng)2h,再與用雜交液按比例(1：8000)稀釋的二抗雜交2h,ECL反應(yīng)顯色?！　?.4RT-PCR法檢測組織中RECK基因的mRNA表達(dá)　　Trizol一步法抽提組織中的總RNA,引物設(shè)計(jì)見參考文獻(xiàn)[2]及國際互聯(lián)網(wǎng)cDNA文庫，由上海生物工程公司合成。RECK(477bp):5-CCTCAGTGAGCACAGTTCAGA-3(上游),5-GCAGCACACACACTGCTGTA-310(下游);β-

8、actin(195bp)：5-CCATGGAGAAGGCTGGG-3(上游)，5-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3(下游)。擴(kuò)增參數(shù)：94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性45秒，60℃復(fù)性45s，72℃延伸45s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72℃延伸加時(shí)10min，4℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳后,采用生物圖像分析儀檢測RECK基因在不同組織中表達(dá)情況?！　?.5結(jié)果判定　　免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)RECK以實(shí)質(zhì)細(xì)胞胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的黃色或