實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)人il9 mrna方法的建立及應(yīng)用

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1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人IL9mRNA方法的建立及應(yīng)用作者：楊先知史燁柳迎昭陳建國(guó)田潔　劉艷劉青玲蘇兆亮仝佳馬斌馬潔邵啟祥許化溪王勝軍【摘要】目的：建立檢測(cè)人白介素9(interleukin9，IL9)mRNA的SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR,qRTPCR)方法。方法：分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)，經(jīng)PMA和離子霉素刺激活化后提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18T載體連接構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

2、。采用qRTPCR方法檢測(cè)IL9mRNA的表達(dá)水平。評(píng)價(jià)該方法的線(xiàn)性及特異性，應(yīng)用該方法檢測(cè)Graves病患者PBMC中IL9mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：建立了人IL9的SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)r2為0.995～0.998，熔解曲線(xiàn)分析產(chǎn)物為單峰。Graves病患者PBMC中IL9mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論：建立的檢測(cè)人IL9mRNA的SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法靈敏、特異性好，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】白細(xì)胞介素9;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

3、;SYBRGreenⅠ11　　[Abstract]Objective:ToestablishaSYBRGreenⅠbasedrealtimefluorescencequantitativePCR(qRTPCR)methodfordetectionhumaninterleukin9(IL9)mRNAexpression.Method:ThespecificprimersweredesignedaccordingtotheconservedsequenceofhumanIL9gene.TotalRNAswereextractedfromhumanperip

4、heralbloodmononuclearcells(PBMC)whichwerestimulatedbyPMAandionomycin,thentheRNAsweretranscribedreverselyintocDNAs.Theplasmidstandardswereconstructed.Thesensitivityandspecificityofthemethodwereevaluated.TherelativeexpressionlevelsofhumanIL9mRNAinPBMCsfrompatientswithGraves′disease(GD

5、)andhealthycontrolsweredetectedbythismethod.Results:Thecoefficientofcorrelationofthestandardcurveofthismethodwas0.995-0.998,meltingcurveanalysisshowedsinglepeak.TherelativeexpressionlevelsofhumanIL9mRNAinGDgroupwerehigherthanthatinhealthycontrolgroup(P<0.01).Conclusion:Themethodt

6、odetectIL9bySYBRGreenⅠbasedqRTPCRwasgoodinsensitivity,specificityandlinearfunction.ItcanbeusedasastandardmethodofqRTPCRfordetectionofhumanIL9expression.　　[Keywords]interleukin9;realtimefluorescence11quantitativePCR;SYBRGreenⅠ　　早先認(rèn)為IL9是由Th2細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，在抗寄生蟲(chóng)感染及過(guò)敏性哮喘中發(fā)揮重要作用。近期研究發(fā)

7、現(xiàn)有一種新的CD4+T細(xì)胞亞群，主要分泌IL9及IL10，稱(chēng)之為“Th9細(xì)胞”,在炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的作用[1-3]。我們建立了一種檢測(cè)人IL9表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR,qRTPCR)方法，并應(yīng)用于Graves病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)中人IL9mRNA的檢測(cè)，為進(jìn)一步研究IL9在臨床中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)手段?！　?材料和方法　　1.1材料　　1.1.1研究對(duì)象Graves病患者組22例(男5例

8、，女17例)，平均年齡(