人rorγt mrna實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

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1、人RORγtmRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用：王海生王勝軍崔大偉陳建國柳迎昭　楊先知史燁田潔仝佳許化溪【摘要】目的：建立檢測(cè)人RORγt(retinoidrelatedorphanreceptorgammat)mRNA的SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR,qRTPCR)方法。方法：根據(jù)人RORγtmRNA的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，提取經(jīng)PMA和離子霉素刺激的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，

2、與pMD18T載體連接構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。采用qRTPCR方法檢測(cè)RORγtmRNA水平，并評(píng)價(jià)該方法的線性、特異性及重復(fù)性。應(yīng)用該方法檢測(cè)Graves病(Graves′disease,GD)患者外周血中RORγtmRNA的相對(duì)表達(dá)。結(jié)果：該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.998，融解曲線分析顯示單個(gè)峰，pMD18TRORγt質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品高、低拷貝數(shù)的批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為6.5%，8.4%和9.6%，11.2%。初步研究表明GD患者組RORγtmRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組(t=-3.72,P<0.01)。結(jié)論：建立的檢測(cè)人RORγtmRNA的SYBRGree

3、nⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法靈敏、特異且重復(fù)性好，為臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】RORγt;實(shí)時(shí)定量PCR;SYBRGreenⅠ　　[Abstract]Objective:ToestablishaSYBRGreenⅠrealtimefluorescentquantitativePCR(qRTPCR)methodforthedetectionofhumanRORγt(retinoidrelatedorphanreceptorgammat)mRNA.Methods：ThespecificprimersanRORγtmRNA.TotalRNAhumanperipheral

4、bloodmononuclearcells(PBMC)stimulatedbyPMAandionomycin,andethodanRORγtmRNAinPBMCsfrompatientsethod.Results：Thecoefficientofcorrelationofthestandardcurveofthismethodeltingcurveidstandardsrespectively.TherelativeexpressionlevelofhumanRORγtmRNAinGDgrouparkedlythanthatinhealthycontrolgroup(t=-3

5、.72,P<0.01).Conclusion：qRTPCRethodforthedetectionofhumanRORγtmRNA,andthismethodservesasatechnologicbaseforclinicalapplication.　　[Keymat;realtimequantitativePCR;SYBRGreenⅠ　　RORγt(retinoidrelatedorphanreceptorgammat)基因是RORC的一種剪接變異體，最初因主要表達(dá)在CD4+CD8+胸腺細(xì)胞而得名[1]。近期研究表明Th17細(xì)胞在炎癥反應(yīng)及自身免疫病等疾病中發(fā)

6、揮了重要作用，RORγt作為Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子可誘導(dǎo)IL17A，IL17F等因子的表達(dá)[2]。本文建立了一種檢測(cè)人RORγt基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR,qRTPCR)方法，并初步應(yīng)用于Graves病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)中RORγtmRNA的檢測(cè)，為研究Th17細(xì)胞的分化和功能提供實(shí)驗(yàn)手段?！　?材料和方法　　1.1材料　　1.1.1研究對(duì)象GD患者組22例，男5例，女17例，平均年齡(31.4±9.4)歲，均為在江蘇大

7、學(xué)附屬人民醫(yī)院就診的經(jīng)臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查符合GD診斷標(biāo)準(zhǔn)的初診患者。健康對(duì)照組18例，男5例，女13例，平均年齡(29.6±6.1)歲，無其他急慢性疾病。　　1.1.2主要試劑和儀器Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，PMA，Ionomycin(Sigma公司)，Trizol(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ToYoBo有限公司)，rTaq酶、dNTP，10×緩沖液，pMD18T，E