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《利用rna干擾技術(shù)抑制單胺氧化酶b 基因的表達(dá)》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、利用RNA干擾技術(shù)抑制單胺氧化酶B基因的表達(dá)【摘要】目的確定并篩選用于特異靜默單胺氧化酶B(MonoamineOxidaseB，MAOB)基因的干擾小RNA(siRNA)片段，建立RNA干擾技術(shù)平臺。方法構(gòu)建含單胺氧化酶B基因siRNA片段的pSilencer1.0-U6siRNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，用RT-PCR和定量PCR方法檢測單氨氧化酶BmRNA的水平。結(jié)果所設(shè)計(jì)的兩段siRNA片段均有干擾MAOBmRNA水平的作用，片段2的作用優(yōu)于片段1，兩個(gè)片段之間有一定的協(xié)同作用。結(jié)論選擇
2、的siRNA片段可以抑制Hela細(xì)胞單胺氧化酶B的表達(dá)?！娟P(guān)鍵詞】RNA干擾，單氨氧化酶B；基因單胺氧化酶B(MonoamineOxidaseB，MAOB)是一種線粒體酶，在腦內(nèi)主要存在于基底核和中腦的神經(jīng)元中，參與多巴胺代謝并被認(rèn)為與神經(jīng)退行性疾病帕金森氏癥有關(guān)［1］。其抑制劑如Deprenyl、Eldepryl、Selegiline等是常用的抗抑郁藥物和神經(jīng)保護(hù)藥物，所有單胺氧化酶B抑制劑都有不同程度的副作用［2］。本研究嘗試用RNA干擾技術(shù)對單氨氧化酶B進(jìn)行特異性的基因沉默，并嘗試用這種低
3、副作用的基因沉默技術(shù)替代傳統(tǒng)的單胺氧化酶B抑制劑。現(xiàn)將使用RNA干擾技術(shù)對單胺氧化酶B進(jìn)行基因表達(dá)抑制的實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。111材料方法1.1siRNA設(shè)計(jì)與質(zhì)粒構(gòu)建以Genebank發(fā)表的MAOBmRNA序列(NM_000898)為模板，用Ambion公司網(wǎng)上提供的專用設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了兩段siRNA序列(19nt)，將設(shè)計(jì)好的特異片段與pSilencerTM1.0-U6質(zhì)粒所需的結(jié)構(gòu)片段連接起來，最終合成了四條兩兩互補(bǔ)的單鏈DNA序列如下：第一對：以下命名為“MAOB-片段1”。5'-AATTA
4、AAAAAAGGGCAAATCATACCCCTTTCTCTTGAAAAGGGGTATGATTTGCCCTGGCC-3'(61BP)5'-AGGGCAAATCATACCCCTTTTCAAGAGAAAGGGGTATGATTTGCCCTTTTTTT-3'(53BP)第二對：以下命名為“MAOB-片段2”。115'-AATTAAAAAAATATGTGGACCTTGGAGGATCTCTTGAATCCTCCAAGGTCCACATATGGCC-3'(61BP)5'-ATATGTGGACCTTGGAGGATTC
5、AAGAGATCCTCCAAGGTCCACATATTTTTTT-3'.按照文獻(xiàn)中提供的siRNA序列［4］設(shè)計(jì)并合成了針對綠色熒光蛋白GFP的兩條互補(bǔ)的單鏈DNA如下：(以下命名為“GFP-片段”)5'-AATTAAAAAAGGCTACGTCCAGGAGCGCATCTCTTGAATGCGCTCCTGGACGTAGCCGGCC-3'(61bp)5'-GGCTACGTCCAGGAGCGCATTCAAGAGATGCGCTCCTGGACGTAGCCTTTTTT-3'(53bp).將上述單鏈DNA用退火緩
6、沖液溶解(1μg/μL)，在PCR儀上退火成雙鏈(90℃3min，37℃1h)，然后將2μL(8ng/μL)雙鏈DNA用T4DNA鏈接酶和線性pSilencerTM1.0-U6質(zhì)粒DNA(500ng)做鏈接反應(yīng)(16℃11過夜)。將連接好的純化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到JM109大腸桿菌中，挑取克隆并用酶切法進(jìn)行初步篩選，然后經(jīng)DNA測序確定所選出的陽性克隆確實(shí)含有所設(shè)計(jì)的片段。富集擴(kuò)增后提取質(zhì)粒(Genopureplasmidmidikit，Roche)，純化定量備用。1.2細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染將HELA細(xì)胞在
7、24孔板(1×104/孔)中用含10％血清的DMEM培養(yǎng)，用Lipofectamine2000(Invitrogen)按說明書將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，48h后提取RNA。為了監(jiān)控質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，設(shè)計(jì)了GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組作為陽性對照組。將細(xì)胞培養(yǎng)在鋪有載玻片的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染U6-RNAi空載或GFP-RNAi質(zhì)粒和pIRES2-EGFP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光，監(jiān)測轉(zhuǎn)染陽性率。同時(shí)平行進(jìn)行MAOB-RNAi實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組只轉(zhuǎn)染U6-MAOB-RNAi質(zhì)粒，并用其空載補(bǔ)齊即
8、可。實(shí)驗(yàn)分組如下：GFP對照組A.不轉(zhuǎn)染對照(control)；B.轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP質(zhì)粒對照(GFP-control)；C.以1∶1比例共轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP質(zhì)粒和U6空質(zhì)粒的對照(RNAi-empty)；D.以1∶1比例共轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP質(zhì)粒和含"GFP片段"的U6質(zhì)粒(GFP-RNAi+GFP-control)。實(shí)驗(yàn)組分組11A.不轉(zhuǎn)染對照(control)；B.轉(zhuǎn)染U6空質(zhì)粒對照(RNAi-empty)；C.轉(zhuǎn)染含MAOB-片段1的質(zhì)粒(MAOB-1)；D.轉(zhuǎn)染含
