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《rna干擾對(duì)綿羊抑制素α亞基基因inha表達(dá)抑制效果 (1)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、萬方數(shù)據(jù)獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得河北盛業(yè)大堂或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：硼p年廠月易夕日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解塑耋堡壘些盤堂有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)塑蘭墾盔些
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3、它是由一個(gè)0【亞基和一個(gè)D亞基通過二硫鍵構(gòu)成的，其中抑制素Q亞基(INHA)是抑制素發(fā)揮生理功能必不可少的。抑制素能抑制雌性動(dòng)物促卵泡素(FSH)的釋放，調(diào)節(jié)卵泡的生成；對(duì)雄性動(dòng)物表現(xiàn)為抑制精子的發(fā)生，降低睪丸的生精能力?？梢姡赏ㄟ^抑制抑制素Q亞基基因的表達(dá)，來降低動(dòng)物體內(nèi)的抑制素水平，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育和精子的生成，繼而提高動(dòng)物的繁殖力。RNA干擾技術(shù)是內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA誘發(fā)的mRNA水平上的基因沉默技術(shù)，具有高度的特異性。然而，根據(jù)以前的研究報(bào)告顯示shRNA表達(dá)載體只能轉(zhuǎn)錄生成一種特異性的小干擾RNA，來阻斷單一靶點(diǎn)的表達(dá)，干擾效率比較低
4、。為了提高shRNA的干擾效率，我們?cè)谝粋€(gè)載體上插入兩個(gè)靶點(diǎn)shRNA表達(dá)序列，即構(gòu)建含有雙啟動(dòng)子的shRNA表達(dá)載體，并將其與單個(gè)靶點(diǎn)shRNA載體的干擾效率作比較。本研究利用RNA干擾技術(shù)，根據(jù)綿羊INHA基因的cDNA序列設(shè)計(jì)構(gòu)建shRNA重組質(zhì)粒，通過雙重PCR方法擴(kuò)增啟動(dòng)子序列，構(gòu)建含有U6和H1雙啟動(dòng)子的不同靶特異干擾序列shRNA表達(dá)載體pGenesill．2-INHAl+2，單個(gè)靶特異性序列的單啟動(dòng)子表達(dá)載體pGenesill．2．INHA以及不針對(duì)任何序列的陰性對(duì)照重組質(zhì)粒pGenesill．2-HK。用Iip2000將陰性對(duì)照、p
5、Genesill．2．INHA、pGenesill．2-INHAI+2分別轉(zhuǎn)染到綿羊的卵泡顆粒細(xì)胞中，用熒光定量PCR的相對(duì)定量法來檢測(cè)轉(zhuǎn)染了48小時(shí)后，各樣品瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后基因的表達(dá)量，計(jì)算干擾的效果。westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞INHA的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如下：1．酶切結(jié)果顯示，試驗(yàn)成功的構(gòu)建了雙啟動(dòng)子shRNA表達(dá)載體pGenesill．2一INHAl+2和單啟動(dòng)子表達(dá)載體pGenesill．2．INHA。2．各重組質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染綿羊卵泡的顆粒細(xì)胞，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48h熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，構(gòu)建的shRNA表達(dá)載體pGe
6、nesill．2-INHA，pGenesill．2-INHAI+2對(duì)INHA基因都有抑制作用，其中雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pGenesill．2-INHAI+2抑制效率較高，基因沉默達(dá)到83％。3．westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，在干擾作用下，細(xì)胞中蛋白的表達(dá)與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比明顯減少，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組pGenesill．2-INHA，pGenesill．2-INHAI+2細(xì)胞中INHA熒光蛋白的表達(dá)量都有降低，而這兩組相比，pGenesill．2．INHAI+2的熒光蛋白表達(dá)量降低更加明顯。結(jié)論：綜上所述，雙啟動(dòng)子shRNA載體轉(zhuǎn)染卵泡的
7、顆粒細(xì)胞后，可顯著降低INHA基因mRNA與蛋白的表達(dá)，相比單個(gè)靶特異性序列的單啟動(dòng)子shRNA載體有更高的抑制效率。關(guān)鍵詞：RNA干擾；shRNA；INHA；qPCR；Westernblot萬方數(shù)據(jù)RNAinterferenceinhibitionofsheepinhibin(1-subunitgeneexpressionAuthor：LiTingSupervisor：ProfessorZhangYingjieMajor：AnimalGenetics，BreedingandReproductionAbstractInhibinisakindofgl
8、ycoproteinhormonessecretedbytheovariangranulosecellsan
