外源性fhit基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細胞系mkn45遷移和侵襲能力的影響

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1、外源性FHIT基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細胞系MKN45遷移和侵襲能力的影響作者：劉飛，黃培林，黃照權(quán)，李楠，徐佳佳，吳鵬【摘要】目的：探討脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細胞MKN45遷移和侵襲能力的影響。方法：將載有人外源性FHIT基因的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1FHIT，轉(zhuǎn)染至FHITmRNA陰性表達的人胃癌細胞MKN45，分別應(yīng)用Millicell小室細胞遷移實驗、Transwell小室侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染前后MKN45細胞遷移能力和侵襲力的改變。結(jié)果：外源性FHIT基因轉(zhuǎn)染MKN45細胞后，MKN45細胞的遷移能力明顯降

2、低(P<0.05)，但細胞侵襲能力無明顯變化(P>0.05)。結(jié)論：外源性FHIT基因轉(zhuǎn)染致MKN45細胞系的遷移能力明顯降低，對MKN45細胞系的侵襲能力無明顯影響?！娟P(guān)鍵詞】脆性組氨酸三聯(lián)體;胃癌;基因轉(zhuǎn)染;遷移;侵襲我國屬胃癌高發(fā)國家，其發(fā)病率與死亡率均居全身惡性腫瘤前列，近年發(fā)病率有增高趨勢。因此，探討胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，做到早期預(yù)防、早期診斷和早期治療，尋找新的治療靶點以及有效的治療方式成為目前研究的熱點。脆性組氨酸三聯(lián)體(fragilehistidinetriad,9FHIT)基因是Ohta等于1996年從上皮

3、癌細胞系3p14.2區(qū)域克隆出的一個候選抑癌基因，在多種腫瘤組織和細胞系中發(fā)現(xiàn)FHIT基因有結(jié)構(gòu)及表達異常的報道[13]。作者用外源性FHIT基因轉(zhuǎn)染FHIT陰性表達的MKN45細胞，觀察其對胃癌細胞遷移、侵襲的影響，為深入研究FHIT基因在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用機制提供新線索。　　1材料與方法　　1.1材料　　人低分化胃腺癌細胞MKN45由東南大學臨床醫(yī)學院中心實驗室饋贈;小鼠成纖維細胞系NIH3T3由東南大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學與病理生理學系實驗室饋贈;培養(yǎng)MKN45細胞用含10%的新生小牛血清、100IU·L-1青霉素和100IU·

4、L-1鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃、濕飽和培養(yǎng)箱培養(yǎng);細胞小室購自美國Millipore公司;RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;脂質(zhì)體Lipofectamin2000購自美國Invitrogen公司;其它生化試劑均為分析純?！　?.2方法　　1.2.1真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1FHIT的轉(zhuǎn)染參照說明書，用Lipofectamine2000將真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1FHIT轉(zhuǎn)染至FHIT基因mRNA陰性表達的人胃癌細胞MKN945。轉(zhuǎn)染后采用G418篩選陽性克隆，并且繼

5、續(xù)培養(yǎng)。用RTPCR法檢測FHITmRNA的表達。　　1.2.2Millicell小室細胞遷移實驗檢測細胞遷移能力變化(1)趨化因子的制備：用含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)NIH3T3細胞至飽和度達80%時棄去原培養(yǎng)液，加入不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液3～4ml，培養(yǎng)24　h后收集培養(yǎng)液，2000r·min-1離心5～10min，取上清液過濾后-70℃凍存?zhèn)溆?。利用饑餓培養(yǎng)的NIH3T3細胞分泌至上清液中的一系列趨化因子，趨化腫瘤細胞向下室運動。(2)分別收集空白對照組(MKN45)、pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(pcDNA

6、3.1MKN45)和pcDNA3.1FHIT轉(zhuǎn)染組(pcDNA3.1FHITMKN45)細胞各1×105個，用含1%FBS的RPMI1640洗滌細胞3次;將小室置入6孔板，在小室內(nèi)加入1×105個細胞，在6孔板內(nèi)加入1600μl趨化液;常規(guī)培養(yǎng)8h后取出小室。用95%酒精固定細胞，然后行HE染色。輕輕用棉簽擦凈小室上室面無侵襲性的細胞，在倒置顯微鏡下放大200倍計數(shù)移至微孔膜下層的細胞數(shù)目，每個樣本隨機選擇10個視野計數(shù)后取均值。實驗重復(fù)3次?！　?.2.3Transwell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲能力變化(1)趨化因子的制備同遷移實驗

7、。(2)侵襲小室的制備：細胞小室為一杯狀結(jié)構(gòu)，杯底由聚碳酸脂膜構(gòu)成，膜孔徑8μm。將人工合成的基底膜材料Matrigel膠用同樣體積的無血清培養(yǎng)液稀釋后，分別取300μg均勻加于每個小室的膜上，十字搖晃使膠平鋪在聚碳酸脂膜上。37℃9成膠30min。使用前加無血清培養(yǎng)液于小室內(nèi)37℃放置20min，使Matrigel膠重新水化。(3)接種細胞：細胞分組同遷移實驗，將細胞小室放入6孔培養(yǎng)板中，在小室外加入1500μl含趨化因子的條件培養(yǎng)液，在小室內(nèi)加入800μl細胞懸液(含1×105個細胞)，常規(guī)培養(yǎng)24～72h，分別在24、48、72h觀察。(

8、4)取出Transwell小室，棄去上室中的培養(yǎng)液，用生理鹽水棉簽輕擦去Matrigel膠，在倒置顯微鏡下觀察侵襲細胞數(shù)。95%乙醇固定15～30mi