外源性fhit基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細(xì)胞系mkn45遷移和侵襲能力的影響

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1、外源性FHIT基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細(xì)胞系MKN45遷移和侵襲能力的影響：劉飛，黃培林，黃照權(quán)，李楠，徐佳佳，吳鵬【摘要】目的：探討脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細(xì)胞MKN45遷移和侵襲能力的影響。方法：將載有人外源性FHIT基因的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1FHIT，轉(zhuǎn)染至FHITmRNA陰性表達的人胃癌細(xì)胞MKN45，分別應(yīng)用Millicell小室細(xì)胞遷移實驗、Transin2000購自美國Invitrogen公司;其它生化試劑均為分析純。　　1.2方法　　1.2.1真核表達

2、質(zhì)粒pcDNA3.1FHIT的轉(zhuǎn)染參照說明書，用Lipofectamine2000將真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1FHIT轉(zhuǎn)染至FHIT基因mRNA陰性表達的人胃癌細(xì)胞MKN45。轉(zhuǎn)染后采用G418篩選陽性克隆，并且繼續(xù)培養(yǎng)。用RTPCR法檢測FHITmRNA的表達?！　?.2.2Millicell小室細(xì)胞遷移實驗檢測細(xì)胞遷移能力變化(1)趨化因子的制備：用含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞至飽和度達80%時棄去原培養(yǎng)液，加入不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液3～4m

3、l，培養(yǎng)24　h后收集培養(yǎng)液，2000r·min-1離心5～10min，取上清液過濾后-70℃凍存?zhèn)溆?。利用饑餓培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞分泌至上清液中的一系列趨化因子，趨化腫瘤細(xì)胞向下室運動。(2)分別收集空白對照組(MKN45)、pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(pcDNA3.1MKN45)和pcDNA3.1FHIT轉(zhuǎn)染組(pcDNA3.1FHITMKN45)細(xì)胞各1×105個，用含1%FBS的RPMI1640洗滌細(xì)胞3次;將小室置入6孔板，在小室內(nèi)加入1×105個細(xì)胞，在6孔板內(nèi)加入16

4、00μl趨化液;常規(guī)培養(yǎng)8h后取出小室。用95%酒精固定細(xì)胞，然后行HE染色。輕輕用棉簽擦凈小室上室面無侵襲性的細(xì)胞，在倒置顯微鏡下放大200倍計數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞數(shù)目，每個樣本隨機選擇10個視野計數(shù)后取均值。實驗重復(fù)3次?！　?.2.3Trans。將人工合成的基底膜材料Matrigel膠用同樣體積的無血清培養(yǎng)液稀釋后，分別取300μg均勻加于每個小室的膜上，十字搖晃使膠平鋪在聚碳酸脂膜上。37℃成膠30min。使用前加無血清培養(yǎng)液于小室內(nèi)37℃放置20min，使Matrigel膠重新水化。

5、(3)接種細(xì)胞：細(xì)胞分組同遷移實驗，將細(xì)胞小室放入6孔培養(yǎng)板中，在小室外加入1500μl含趨化因子的條件培養(yǎng)液，在小室內(nèi)加入800μl細(xì)胞懸液(含1×105個細(xì)胞)，常規(guī)培養(yǎng)24～72h，分別在24、48、72h觀察。(4)取出Transin，HE染色。(5)在倒置顯微鏡下放大200倍計數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞數(shù)目，每個樣本隨機選擇10個視野計數(shù)后取均值。實驗重復(fù)3次，細(xì)胞體外侵襲力以侵入濾膜下層的細(xì)胞數(shù)來判定?！　?.3統(tǒng)計學(xué)處理　　實驗結(jié)果以x±s表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方

6、差分析，多重比較采用LSD法，P<0.05為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。統(tǒng)計結(jié)果的圖形化由Excel2000繪圖程序完成?！　?結(jié)果　　2.1重組質(zhì)粒pcDNA3.1FHIT轉(zhuǎn)染MKN45細(xì)胞后FHIT基因mRNA的表達情況pcDNA3.1FHIT轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有462bp大小的目的基因條帶出現(xiàn)，而pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組均無目的條帶出現(xiàn)(圖1)?！　?.3FHIT基因轉(zhuǎn)染對MKN45細(xì)胞侵襲能力的影響　　Transarini等[7]在研究p53缺失引起的以微管為靶位化療藥抵抗中發(fā)

7、現(xiàn)伴有FHIT表達量的相應(yīng)改變，表明FHIT可能通過影響微管的組裝來發(fā)揮其抑制腫瘤的作用。因此，F(xiàn)HIT基因及所表達的蛋白作為微管相關(guān)蛋白可能參與影響微管的組裝，從而影響遷移的發(fā)生，其具體機制有待以后進一步的實驗證實?！　”緦嶒炘赥ransinogenactivator,uPA)，后者主要降解其中的糖蛋白及蛋白聚糖中的多糖鏈。參與破壞細(xì)胞外基質(zhì)的酶類具有不同程度的特異性，MMP是主要的直接作用者，它通過對細(xì)胞外基質(zhì)中不同成分的降解，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。胃癌研究中發(fā)現(xiàn)MMP高表達與胃癌的

8、發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。本實驗上室中的細(xì)胞穿越膜上濾膜的下表面，其數(shù)量的多少反映了該細(xì)胞侵襲能力。侵襲實驗結(jié)果提示，F(xiàn)HIT基因的表達水平與MKN45細(xì)胞的侵襲力改變無明顯相關(guān)性?！　∧[瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是多階段、多基因參與的過程，相關(guān)基因的調(diào)節(jié)機制異常復(fù)雜，涉及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，阻斷其表達或其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將有可能為抗腫瘤治療提供一些較為理想的思路?！緟⒖嘉墨I】　[1]CANTORJP,ILIOPOULOSSD,RAOAS,etal.Epigeicmodulationofendogenoustu