微板賴氏法酶標(biāo)儀點(diǎn)對點(diǎn)定量測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力

《微板賴氏法酶標(biāo)儀點(diǎn)對點(diǎn)定量測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、微板賴氏法酶標(biāo)儀點(diǎn)對點(diǎn)定量測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力【關(guān)鍵詞】丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；無償獻(xiàn)血；微板賴氏法　　丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的測定，是對無償獻(xiàn)血者及大量體檢時(shí)不可缺少的項(xiàng)目之一。目前大多還是采用賴氏試管法來測定，筆者利用酶標(biāo)儀點(diǎn)對點(diǎn)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用微板賴氏法進(jìn)行測定，既省工、省試劑，也利于原始數(shù)據(jù)的歸檔管理，現(xiàn)介紹如下?！　?材料與方法　　1.1儀器MK2型酶標(biāo)儀；微量加樣器；1011型半自動生化分析儀；96孔平底微孔板、電熱恒溫水溫箱、定時(shí)針?！　?.2試劑ALT賴氏法試劑（上海榮盛生物試劑廠）。ALT定值血清：

2、x=31.5（購自北京九強(qiáng)公司）?！　?.3方法　　1.3.1建立標(biāo)準(zhǔn)曲線按下表加樣，每管平行做3份。各加入2,4二硝基苯肼液50μl充分混勻，在電熱恒溫水溫箱中37℃溫育20min后，各管加入0.8mol/LNaOH溶液200μ6l，充分混勻，靜置10min，在酶標(biāo)儀上選擇基礎(chǔ)酶聯(lián)模式，測量模式以測定波長492nm，參考波長630nm，以“0”號管為空白管，計(jì)算方式利用點(diǎn)對點(diǎn)（PointtoPoint）數(shù)據(jù)處理程序來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并用（SAVE）鍵保存，依次輸入酶活力單位值，平行份數(shù)及位置，然后確定，按“Start”鍵測定，系統(tǒng)自動

3、根據(jù)不同酶活力單位與對應(yīng)的平均A值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)過分析認(rèn)為曲線良好，然后按“SAVE”鍵，選擇一個(gè)序號將其保存。注意下次建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，可以按上述步驟建立，也可以直接利用“SAVE”鍵調(diào)出原來的標(biāo)準(zhǔn)曲線序號，按“Start”選擇建立新標(biāo)準(zhǔn)曲線模式來自動建立?！　?.3.2標(biāo)本測定在微板上設(shè)A1為空白孔，加10μl磷酸鹽緩沖液，50μl基質(zhì)液；測定孔加標(biāo)本10μl，然后分別加入50μl基質(zhì)液，充分混勻，然后再在37℃溫育30min后每孔加入2,4二硝基苯肼50μl，混勻，37℃溫育20min，每孔加入0.8mol/LNaOH溶液20

4、0μl，充分混勻室溫靜置10min后，在酶標(biāo)儀基礎(chǔ)酶聯(lián)模式下按“SAVE”鍵選擇序號，調(diào)出保存的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按“Start”選擇“利用舊標(biāo)準(zhǔn)曲線測量模式”直接進(jìn)行測定，結(jié)果ALT酶活力單位直接被打印出來?！　?.3.3微板賴氏法點(diǎn)對點(diǎn)測定的準(zhǔn)確性估計(jì)6從本中心血庫無償獻(xiàn)血者標(biāo)本中隨機(jī)抽取20份標(biāo)本，分析用微板賴氏法酶標(biāo)儀點(diǎn)對點(diǎn)和試管賴氏法來測定ALT，將結(jié)果做配對資料t檢驗(yàn)，借以估計(jì)二者是否存在顯著差異，間接評估其準(zhǔn)確性?！　”?點(diǎn)對點(diǎn)測定的準(zhǔn)確性估計(jì)（略）　　1.3.4微板賴氏法酶標(biāo)儀點(diǎn)對點(diǎn)測定ALT的精密度估計(jì)在每天日常檢驗(yàn)工作中，

5、每天加檢一份ALT定值質(zhì)控血清樣品，采用微板賴氏法酶標(biāo)儀點(diǎn)對點(diǎn)法和試管賴氏法測定ALT，連續(xù)20次，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)，判斷其精密度。　　1.3.5微板賴氏法酶標(biāo)儀點(diǎn)對點(diǎn)測定ALT重復(fù)性估計(jì)從微板賴氏法酶標(biāo)儀測定的無償獻(xiàn)血者1390人中，隨機(jī)抽取25份標(biāo)本，重復(fù)測定，2次結(jié)果做配對差值統(tǒng)計(jì)分析，判斷其重復(fù)性?！　?結(jié)果　　20份隨機(jī)抽取的標(biāo)本，微板法與試管法做對照（表2），經(jīng)成對資料t檢驗(yàn)，t=0.481，P＞0.05微板法與試管法無差異，與張根倉等結(jié)果一致［1］。微板法測定20份質(zhì)控血清，其均值=30.9，s=2.0，CV=7%

6、。試管法測定20份質(zhì)控血清，其均值=32.4，s=2.9，CV=9%。微板法測定無償獻(xiàn)血者1390人，ALT不合格50人，不合格率為3.5%。隨機(jī)抽取25份標(biāo)本重復(fù)測定，兩次結(jié)果經(jīng)配對差值統(tǒng)計(jì)分析（n=25），d=0.275，s=4.32，t=0.318，P＞0.05，說明重復(fù)性較好?！　?討論6　　試管法與微板法同測隨機(jī)抽取的20份標(biāo)本，經(jīng)配對資料t檢驗(yàn)結(jié)果差異無顯著性，用微板法測定20份質(zhì)控血清，CV為7%，說明微板法ALT檢測結(jié)果的精密度合乎要求，重復(fù)測定25份標(biāo)本，2次結(jié)果經(jīng)配對差值分析重復(fù)性較好。證明采供血機(jī)構(gòu)日常采用該方法

7、檢測血樣ALT符合要求。賴氏法測定ALT時(shí)由于底物濃度的明顯不足使得酶促反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸的量與酶活性間不能呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。因此，筆者認(rèn)為利用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定ALT比張根倉［1］用一點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)測定ALT更能準(zhǔn)確地反映酶的活力，而且線性范圍比較寬，特別是對25μ/L臨界值測定的準(zhǔn)確性較高，更利于對無償獻(xiàn)血者ALT的篩檢測定（無償獻(xiàn)血者以ALT＜25%為合格）。注意每換一批試劑，均應(yīng)重作標(biāo)準(zhǔn)曲線。高測定波長49.2nm，參考波長630nm用雙波長測定可以克服輕度脂血等多種因素的干擾，因?yàn)檩p度脂血在492nm與630nm處吸收值接近，而欲測成分丙酮

8、酸在該雙波長處吸收值差異有顯著性，從而最大限度地去掉輕度脂血帶來的影響。劉玉振［2］等已討論過，微板賴氏法是對點(diǎn)測定ALT，由于酶標(biāo)儀可以在2s內(nèi)快速讀取96份測定標(biāo)本的A值并能由預(yù)先測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線將ALT結(jié)果直接計(jì)算出