ptdp53 融合蛋白的表達(dá)、純化及其對(duì)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性

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1、PTDp53融合蛋白的表達(dá)、純化及其對(duì)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性作者：丁忠陽(yáng)，蔡兵，穆會(huì)君，孫力，俞悅，高云【摘要】目的:原核表達(dá)野生型p53與PTD的融合蛋白,檢測(cè)PTD介導(dǎo)p53進(jìn)入肝癌細(xì)胞的效率。方法:利用RTPCR方法從A549細(xì)胞系中分離野生型p53基因,將該基因分別克隆入pTATHA和pET32a原核表達(dá)載體,在大腸桿菌BL21(DE3)LysS內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行純化。以純化的p53蛋白經(jīng)腹腔免疫BALB/c小鼠,制備高效價(jià)的抗血清。將PTDp53融合蛋白加入HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清,利用間接免疫熒光法檢測(cè)PTDp

2、53融合蛋白導(dǎo)入HepG2細(xì)胞的效率。結(jié)果:成功地構(gòu)建了含有野生型p53基因的原核表達(dá)載體,表達(dá)純化了p53融合蛋白及p53蛋白,證實(shí)PTDp53可以高效地轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞。結(jié)論：PTDp53融合蛋白的表達(dá)純化及活性分析,為應(yīng)用PTDp53蛋白治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究奠定了理論基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】PTDp53融合蛋白；表達(dá)；純化；肝癌　p53基因是目前研究最廣泛最深入的抑癌基因,在細(xì)胞受到損害導(dǎo)致DNA斷裂時(shí),p53蛋白可使細(xì)胞分裂停滯在G1/S期；11如損傷不能修復(fù),p53基因則啟動(dòng)細(xì)胞的程序性死亡過(guò)程而引發(fā)細(xì)胞凋亡；一

3、旦p53基因缺失或突變失活,則將導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、無(wú)限制增殖從而引發(fā)癌癥。因此如果將p53蛋白導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞就能發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。PTD(proteintransductiondomain)是一個(gè)富含堿性氨基酸殘基的蛋白結(jié)構(gòu)域,PTD融合蛋白系統(tǒng)被認(rèn)為是一種很有前途的運(yùn)載工具[1]。為了探索將p53高效引入腫瘤細(xì)胞治療腫瘤性疾病的新途徑,我們制備了蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域Tat與p53的融合蛋白。理論上TatPTD可以發(fā)揮高效的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)特性將p53導(dǎo)入肝癌細(xì)胞內(nèi),并且TatPTD上的核定位序列還可將p53引入細(xì)胞核，p53在細(xì)胞核內(nèi)可

4、以發(fā)揮其生物學(xué)活性,抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[2]?！　?材料和方法　　1.1材料TrizolReagent購(gòu)自Invitrogen生物技術(shù)公司；RTPCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶及連接酶為上海塔卡拉公司產(chǎn)品；核酸電泳低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和IPTG均為華美公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；NiNTAagarosePD10購(gòu)自上海生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pTATHA質(zhì)粒由美國(guó)Dowdy公司提供；A549細(xì)胞株由南京醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室

5、提供；大腸桿菌JM109、BL21(DE3)LysS由第三作者所在研究所保存；小鼠購(gòu)買于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重26～38g；肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞由南京醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室提供。11　　1.2方法　　1.2.1p53基因的克隆和原核表達(dá)載體構(gòu)建RTPCR引物由南京奧科生物技術(shù)有限公司合成,上游引物5′GCGCGGTACCATGGAGGAGCCGCAGTCAG3′，下游引物5′GCGCGAATTCTCAGTCTGAATCAGGCCCTT3′。在50μl體系中進(jìn)行一步法RTPCR,純化的PCR產(chǎn)物以KpnⅠ及E

6、coRⅠ雙酶切,回收酶切產(chǎn)物。將質(zhì)粒pTATHA和pET32a分別用KpnⅠ及EcoRⅠ雙酶切,回收酶切產(chǎn)物。以T4DNA連接酶將p53基因分別克隆入原核表達(dá)載體pTATHA和pET32a,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞,以含Amp的固體培養(yǎng)基(LB)篩選陽(yáng)性克隆,小量提取質(zhì)粒后,用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定。測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成?！　?.2.2p53基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建將(DE3)LysS接種于含Amp的LB培養(yǎng)液37℃振搖過(guò)夜,次日按1∶100轉(zhuǎn)種于2L新鮮的LB培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4h,加入IPT

7、G至終濃度為1mmol·L-1,繼續(xù)培養(yǎng)4h后離心收菌。以含8mol·L-1尿素的裂解液進(jìn)行裂解,冰浴中超聲8×15s,離心棄沉淀。將上清中加入1mlNiNTA瓊脂糖,室溫、150r·min-1吸附1h。5000r·min-1離心5min后棄上清,以20mmol·L-1咪唑洗滌沉淀。依次用100、200、500mmol·L-1咪唑溶液進(jìn)行洗脫,收集洗脫液進(jìn)行SDSPAGE分析并凝膠掃描測(cè)定蛋白純度,BCA法測(cè)定純化蛋白的濃度。11　　1.2.3Tatp53融合蛋白的小量表達(dá)及鑒定以pTATHA/p53原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大

8、腸桿菌BL21(DE3)LysS。挑取單克隆接種于3ml含Amp的LB培養(yǎng)液37℃振搖過(guò)夜,1∶100接種于新鮮LB培養(yǎng)液振搖培養(yǎng)4h,加入IPTG至終濃度為0.1mmol·L-1,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,取1ml菌液以12000r·min-1離心5min,收集菌體加入1×SDS上樣緩沖液100μl,煮沸5mi