tategfp融合蛋白的表達(dá)及在pc12細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性

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1、TATEGFP融合蛋白的表達(dá)及在PC12細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性【摘要】　　目的：構(gòu)建pET28aTATEGFP重組子,觀察表達(dá)的融合蛋白TATEGFP在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性.方法：人工合成編碼TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)的DNA片段，插入載體pET28a后再連接EGFP基因，組成pET28aTATEGFP重組表達(dá)子.轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)TATEGFP融合蛋白表達(dá)，組氨酸親和層析柱純化.將融合蛋白加入培養(yǎng)的PC12細(xì)胞，觀察熒光進(jìn)入細(xì)胞的情況.結(jié)果：成功地構(gòu)建了高表達(dá)pET28aTATEGFP重組子，純化了分子質(zhì)量約為29

2、ku的融合蛋白TATEGFP,并在體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞中證實(shí)TATEGFP融合蛋白穿透生物膜的能力.結(jié)論：通過對TATEGFP融合蛋白的表達(dá)純化及活性分析,證實(shí)了TAT的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，為肽類及生物大分子藥物進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮治療作用提供了理論基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域重組融合蛋白質(zhì)類PC12細(xì)胞0引言　　隨著生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展,蛋白質(zhì)與多肽類藥物相繼出現(xiàn)，但由于生物膜的屏障作用,只有少數(shù)小分子物質(zhì)能進(jìn)入組織，許多具有治療作用的外源性生物大分子難以穿過生物膜在病灶達(dá)到有效濃度，從而給許多疾病的治療造

3、成困難.近年來發(fā)現(xiàn)一種于人類免疫缺陷病毒HIV1的轉(zhuǎn)錄激活因子(transactivator,TAT)，能夠有效引導(dǎo)肽段或者蛋白質(zhì)穿透細(xì)胞膜，其分子中具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的基本結(jié)構(gòu)是一個富含堿性氨基酸的多肽片段，這一多肽片段被稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（Proteintransductiondomain,PTD).TAT的發(fā)現(xiàn)在蛋白功能和疾病治療的研究中具有重要的應(yīng)用價值.我們利用增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）作為報告蛋白，通過構(gòu)建TAT與EGFP的融合表達(dá)載體，

4、利用組氨酸親和層析柱純化TATEGFP融合蛋白,并與培養(yǎng)的PC12細(xì)胞作用，觀察能否穿過生物膜屏障,探討TAT作為跨膜的細(xì)胞內(nèi)傳遞作用，為蛋白類生物大分子的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料pET28a質(zhì)粒、E.coliBL21(DE3)(Novagen公司)；質(zhì)粒pEGFPN3，PC12細(xì)胞株由本試驗(yàn)室保存.T4DNA連接酶、NheI，XhoI，EcoRI，IPTG（華美生物工程公司）；質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒（大連寶生物公司）；組氨酸親和層析柱、咪唑（Pharmacia公司）；凝膠圖像分析儀（美國Syu

5、gene公司）；HD1000核酸蛋白檢測儀（上海嘉鵬科技有限公司）；TAT雙鏈與EGFP的引物合成及DNA測序由上海生物工程公司完成.1.2方法1.2.1TAT的合成按照TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)4860位氨基酸（YGRKKRRQRRR）的序列，人工合成了編碼PTD的DNA片段：正義鏈為5′AAAgCTAgCggCTATggCCgTAAAAAACgTCgTCgTCgTggCgAATTCAAA3′，下劃線分別為NheI，EcoRI酶切位點(diǎn)，反義鏈略.兩段DNA片段在95℃變性30min后，置于90℃水浴的保溫瓶中緩慢退火過夜，退

6、火后得到雙鏈片段.1.2.2EGFP的PCR引物設(shè)計(jì)以pEGFPN3為模板設(shè)計(jì)引物，上游引物:5′AAAgAATTCATggTgAgCAAgggCgAggAg3′，下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn).下游引物:5′TTTCTCgAgTTACTTgTACAgCTCgTCCATg3′下劃線為XhoI酶切點(diǎn).1.2.3EGFP的cDNA片段的擴(kuò)增以pEGFPN3為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μL,分別加入引物、Taq酶、dNTP，10×Buffer等.擴(kuò)增步驟如下:94℃變性5min,50℃退火45s,72℃延伸10min

7、,循環(huán)28次,再94℃變性1min.PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)10g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶切后回收EGFP的cDNA片段備用.1.2.4pET28aTATEGFP與pET28aEGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建將TAT雙鏈片段經(jīng)NheI，EcoRI雙酶切后回收，與經(jīng)同樣酶切回收的Pet28a載體連接，構(gòu)成pET28aTAT重組質(zhì)粒.重組質(zhì)粒用EcoRI,XhoI雙酶切消化,由T4DNA酶定向插入連接備用的EGFP片段，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)細(xì)胞，挑取陽性克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定得到正確的重組融合表達(dá)載體pET28aTATEGF

8、P.同時參考以上方法構(gòu)建對照質(zhì)粒pET28aEGFP.1.2.5pET28aTATEGFP在大腸桿菌中的表達(dá)及純化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21,形成穩(wěn)定的高表達(dá)細(xì)菌株.在含0.05g/L卡那霉素的LB平板上劃單菌落，挑取單菌落至3mL的LB培養(yǎng)液中放大培養(yǎng),細(xì)菌生長至對數(shù)期加1mmol/LIPTG誘導(dǎo)4～5h,收集細(xì)菌,PB