抗菌肽及其在植物抗病基因工程中的應(yīng)用

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1、抗菌肽及其在植物抗病基因工程中的應(yīng)用汪小福1，2，高智謀1，陳錦清2（1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院，合肥230036；2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，杭州310021）1抗菌肽的分類廣義的抗菌肽(antibacterialpeptides)是指廣泛存在于生物體內(nèi)對(duì)生物體具有抵御外界微生物的侵害,清除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類小分子多肽，它們?cè)趧?dòng)物的免疫細(xì)胞、空腔臟器粘膜、皮膚以及植物中都廣泛存在。根據(jù)抗菌肽的來(lái)源不同可以將抗菌肽分為以下幾類：1.1防御素是指吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的一類具特征性β片層結(jié)構(gòu)和廣譜抗微生物活性的小分子多肽。防御素廣義上代表一大類具廣譜抗微生物活性并有特征性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的小

2、分子陽(yáng)離子多肽(cationicpeptides)，但通常是指脊椎動(dòng)物吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的防御素，或稱髓系防御素(myeloiddefensins)。1.2昆蟲抗菌肽根據(jù)其結(jié)構(gòu)與功能可大致分為4類：天蠶素類（Cecropins），昆蟲防御素（insectdefensins），富含脯氨酸的抗菌肽(proline-richpeptides)和富含甘氨酸的抗菌肽(glycine-richpeptides)。（1）天蠶素類：天蠶素是最早發(fā)現(xiàn)的抗菌肽，它對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都有較高的抗性。1980年Boman等首次分離到純的天蠶素A和B。翌年，Boman又與Bennich等人合作測(cè)定了天蠶素A和B

3、的一級(jí)結(jié)構(gòu)，隨后在柞蠶肉蠅、煙草天蛾中都發(fā)現(xiàn)了天蠶素或類似天蠶素的抗菌肽。這些抗菌肽的分子結(jié)構(gòu)相似：都有31-39個(gè)氨基酸殘基組成；分子質(zhì)量為4kDa左右；半胱氨酸(Cys)含量少，不能形成分子內(nèi)二硫鍵；有強(qiáng)堿性的N端和疏水性強(qiáng)的C端；在肽的許多特定位置有較保守的殘基，如2位具有色氨酸(Try)，5、8、9位具有1個(gè)或1對(duì)賴氨酸（Lys），11位具有天冬氨酸(Asn)，12位具有精氨酸(Arg)；有些位置盡管殘基不同，但仍是保守替換。1988年，Halak等人利用二維核磁共振技術(shù)測(cè)定天蠶素A的三級(jí)結(jié)構(gòu)。N端1-4位4個(gè)氨基酸是非螺旋化的。天蠶素A的分子結(jié)構(gòu)含有2段α-螺旋。5-21位

4、為第1個(gè)α-螺旋，該螺旋中極性與非極性氨基酸含量相當(dāng)，因此，該螺旋對(duì)水和脂都具有親和性，稱為雙親的α-螺旋。25-37位為第2個(gè)α-螺旋，其中疏水氨基酸含量高，故該α-螺旋疏水性強(qiáng)。22-24位形成一個(gè)Ala-Gly-Pro的結(jié)節(jié)部，這個(gè)結(jié)節(jié)部在其它細(xì)胞膜毒素(如pardaxin、melittin、alamethicin)中普遍存在?？梢酝浦?，此種結(jié)構(gòu)與天蠶素的抗菌活性密切相關(guān)。此外，所有昆蟲的抗菌肽都酰胺化，天蠶素類也不例外，其C端的酰胺化，對(duì)其廣譜性極其重要。（2）昆蟲防御素：第1種昆蟲防御素由Masturyama于1988年在一種雙翅目昆蟲肉(Sarcophagaperegri

5、na)中發(fā)現(xiàn)。至今，昆蟲綱中已有15大類30多種防御素被報(bào)道。發(fā)現(xiàn)有防御素的昆蟲包括雙翅目(5種)、鞘翅目（2種）、膜翅目（1種）、毛翅目（1種）、半翅目（1種）、蜻蜓目（1種）；但在鱗翅目昆蟲尚未發(fā)現(xiàn)防御素。絕大多數(shù)昆蟲防御素的分子質(zhì)量為4kDa左右，由38-43個(gè)氨基酸殘基組成。僅有1-2個(gè)例外：一種是肉蠅肽(sapecin_B)，由34個(gè)氨基酸殘基組成；另一種是從膜翅目昆蟲意大利蜂(Apismellifera)中得到的royalisin，由51個(gè)氨基酸殘基組成。昆蟲防御素都有1個(gè)靜電荷，且氨基酸序列中都含6個(gè)位置很保守的Cys，能形成3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。綠蠅防御素(phormia

6、defensin)是研究得最清楚的防御素。該分子由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：一個(gè)柔韌的N端環(huán)，一個(gè)親水脂的α-螺旋中心，一個(gè)帶有擬β轉(zhuǎn)角反向平行的β片層。不同種類昆蟲的防御素分子結(jié)構(gòu)具有很大的同源性，其主要差異在N端環(huán)的大小。而且Cys-X-X-X-Cys或Cys-X-Cys(X代表任意氨基酸)結(jié)構(gòu)普遍存在，使α-螺旋通過(guò)分子內(nèi)二硫鍵得以穩(wěn)定。昆蟲防御素可以抗革蘭氏陰性菌，而對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌幾乎無(wú)作用。與哺乳動(dòng)物防御素不同，昆蟲防御素對(duì)真菌及真核細(xì)胞不起作用。（3）富含脯氨酸的抗菌肽：這是20世紀(jì)80年代才發(fā)現(xiàn)的一類新型的昆蟲抗菌肽。1989年Casteels等首先從膜翅目的意大利蜂(A.mel

7、lifera)發(fā)現(xiàn)：這類抗菌肽都由15-34個(gè)氨基酸殘基組成，其中，Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)在25℅以上，它們都帶有正電荷，都含有Arg-Pro(R.P)或Lys-Pro(K.P)氨基酸對(duì)，有些帶有典型的Arg-Pro-Arg(R.P.R)結(jié)構(gòu)。但是這類抗菌肽除上述小分子肽類外，還包括一些分子量較大的肽，如雙翅肽(diptericin)。在綠蠅、果蠅中都有雙翅肽，都是由83個(gè)氨基酸殘基組成的，一級(jí)結(jié)構(gòu)相似，最大的特點(diǎn)是整個(gè)分子可分為2個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)域。在N端是一個(gè)短的