電子克隆技術及其在植物基因工程中的應用

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1、第37卷第3期東北農(nóng)業(yè)大學學報37(3):403~4082006年6月JournalofNortheastAgriculturalUniversityJune2006文章編號1005-936（92006）03-0403-06電子克隆技術及其在植物基因工程中的應用*王冬冬,朱延明,李勇,李杰,柏錫（東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150030）摘要：電子克隆是隨著基因組計劃和EST計劃的實施而發(fā)展起來的,是利用生物信息學手段進行基因克隆的新方法。它具有投入低、速度快、技術要求低和針對性強等優(yōu)點。因此,電子克隆技術必將成為

2、植物基因工程中獲得新基因的重要手段。闡述了電子克隆應用所依據(jù)的數(shù)據(jù)庫與生物信息資源,介紹了利用電子克隆獲得功能基因的方法,及其在植物基因工程中的應用現(xiàn)狀與前景。關鍵詞：電子克隆;植物基因工程;表達序列標簽EST;生物信息學中圖分類號：Q785;Q943.2文獻標識碼：A電子克隆(insilicocloning)是近年來伴隨著基因的研究內(nèi)容之一。生物信息學資源是由數(shù)據(jù)庫、計組計劃和EST計劃發(fā)展起來的基因克隆新方法。算機網(wǎng)絡和應用軟件三大部分組成。而電子克隆的電子克隆的技術原理是利用日益發(fā)展的生物信息應用即是基于這三部分生物信

3、息學資源而展開的。學技術,借助電子計算機的巨大運算能力,通過它是利用計算機技術,依托現(xiàn)有的網(wǎng)絡資源(ESTEST或基因組的序列組裝和拼接,利用RT-PCR的數(shù)據(jù)庫、核苷酸數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、基因組數(shù)方法快速地獲得新基因。國際上Boguski等學者在據(jù)庫等),采用生物信息學方法(包括同源性檢索、1994年開始利用電子克隆方法發(fā)現(xiàn)新基因,中國聚類、序列拼裝等),通過EST或基因組的序列組科學院生物物理研究所陳潤生研究組在1996也開裝和拼接,利用RT-PCR快速地獲得部分乃至全[1]始了對電子克隆的研究。長cDNA序列的方法。

4、電子克隆技術應用的前提條件要具備擬研物1.2電子克隆的實施方案種的豐富核酸序列信息,其他物種的相關基因的首先,在數(shù)據(jù)庫或PubMed中獲得感興趣的信息,以及強大的計算機硬件和相關生物信息學cDNA或氨基酸序列,基于EST和基因組信息兩種分析軟件。基因組和EST資料的豐富程度決定了數(shù)據(jù)資源,利用上述得到的已知基因序列實施電子電子克隆得以在人類、小鼠等生物中廣泛應用。克隆有以下兩種方案。由于受到序列資料的限制,植物基因的電子克隆利用EST數(shù)據(jù)庫信息資料:①利用序列同源還鮮有報道。但隨著植物基因組計劃和功能基因性比較軟件(如Bla

5、st軟件)將種子序列對庫檢索;組學的發(fā)展,電子克隆在植物基因工程研究中必②從數(shù)據(jù)庫中挑選出全部相關序列;③對所有序列將發(fā)揮出巨大的功用。進行片段整合分析(即Contig分析),形成延伸后的序列,稱新生序列。隨后,將此新生序列作為種子1電子克隆技術及其依托的生物信序列重復進行上述三步過程,直至新生序列不能被息學資源進一步延伸為止,通過完整性分析即獲得了全長的[2-3]新基因序列。見圖1。1.1電子克隆的基本原理利用基因組信息資料:把作為信息探針的氨基利用電子克隆方法獲得新基因是生物信息學酸或核苷酸序列在NCBI網(wǎng)站中對特定物種

6、各基因收稿日期：2005-01-14組數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析,從結(jié)果中篩選出感興基金項目：國家自然科學基金(30471059)趣的外顯子序列,并通過鏈接得到其所在的基因組作者簡介：王冬冬(1981-),女,黑龍江人,碩士研究生,研序列,同時根據(jù)比對的結(jié)果對基因組序列可能造成究方向為植物分子生物學與植物基因工程。*通訊作者E-mail:ymzhu2001@hotmail.com的移碼測序錯誤進行修正;把這些感興趣的外顯子·404·東北農(nóng)業(yè)大學學報第37卷序列按照其所在基因組上的位置依次進行直接連BLAST分析,檢驗其新穎性;

7、把篩選后的新基因接,或者把基因組序列提交到GenScan和序列提交到dbEST數(shù)據(jù)庫做BLAST分析并延伸,GeneFinder等網(wǎng)站進行預測,得到可能的新基因序同時也是進一步確認其真實存在的可信度,并進行列。有時各外顯子分別處于較短的尚未組裝的基組織表達定位,為克隆該基因提供組織來源信息。因組序列中,也可按探針基因外顯子順序進行直最后根據(jù)最終的序列設計引物,進行RT-PCR實[4]接拼接;把可能的新基因序列基于核酸數(shù)據(jù)庫做驗得到新基因。見圖2。感興趣的EST序列感興趣的外顯子序列及基因組序列Blast(dbEST)cont

8、ig或BAC/PAC克隆相似的EST片段獲得其側(cè)翼基因組序列聚類,拼接,延伸序列重疊群(contig)重復Blast外顯子預測,拼接不能再延伸的Contig可能的新基因序列分析完整性分析完整性獲得全長cDNA序列獲得基因全長序列RT-PCR、克隆、測序、功能鑒定RT-PCR、克隆、測序、功