淀粉酶的提取- α-淀粉酶的提取、分離及測定

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1、α-淀粉酶的提取、分離及測定（生化試驗小組-2005.4）試驗全程安排：第一天樣品的粗處理及粗分離，包括：1）樣品處理2）離子交換色譜分離3）紫外檢測（紫外測定蛋白），繪出色譜圖4）收集樣品第二天對各峰收集樣品進行分析，包括：1）精確測定蛋白含量（Folin-酚）2）測定酶活3）比活計算第三天對活性峰及原液進行分析及鑒定，包括：1）SDS－PAGE分析（分子量分析）2）純化倍數(shù)計算等試驗一、色譜分離淀粉酶1.1試劑及設(shè)備離子交換樹脂-20℃冰箱樣品管（5-10ml試管）1.5ml離心管紫外分光光度計α-淀粉酶樣品秒表膠頭吸管（

2、進樣用）平衡緩沖液（pH8.0，0.01M磷酸鹽緩沖液）洗脫緩沖液（平衡緩沖液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化鈉）試劑瓶1.2離子交換色譜原理與方法色譜(chromatography)是一種分離的技術(shù),隨著現(xiàn)代化學(xué)技術(shù)的發(fā)展應(yīng)運而生。20世紀初在俄國的波蘭植物化學(xué)家茨維特(Twseet)首先將植物提取物放入裝有碳酸鈣的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸鈣中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈現(xiàn)出不同的顏色，這樣就可以對各種不同的植物提取液進行有效的成分分離。到1907年茨維特的論文用俄文公開發(fā)表，他把這種方法命名為ch

3、romatography,即中文的色譜，這就是現(xiàn)代色譜這一名詞的來源。但由于茨維特當時沒有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆發(fā)了第一次世界大戰(zhàn)，茨維特的分離方法一直被束之高閣。20世紀20年代，許多植物化學(xué)家開始采用色譜方法對植物提取物進行分離，色譜方法才被廣泛地應(yīng)用。自20世紀40年代以來以Martin為首的化學(xué)家建立了一整套色譜的基礎(chǔ)理論使色譜分析方法從傳統(tǒng)的經(jīng)驗方法總結(jié)歸納為一種理論方法，馬丁等人還建立了氣相色譜儀器使色譜技術(shù)從分離方法轉(zhuǎn)化為分析方法。20世紀50年代以后由于戰(zhàn)后重建和經(jīng)濟發(fā)展的需要，化學(xué)工業(yè)特

4、別是石油化工得到廣泛的發(fā)展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。而石化成分十分復(fù)雜，結(jié)構(gòu)十分相似，且多數(shù)成分熔點又比較低，氣相色譜正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明顯、有效。同樣，石化工業(yè)的發(fā)展也使色譜技術(shù)特別是氣相色譜得到廣泛的應(yīng)用。氣相色譜的儀器也不斷得到改進和完善，氣相色譜逐漸成為一種工業(yè)分析必不可少的手段和工具。20世紀80年代以后我國也大規(guī)模采用氣相色譜和高效液相色譜。隨著環(huán)境科學(xué)的發(fā)展，不僅需要對大量有機物質(zhì)進行分離和檢測，而且也要求對大量無機離子進行分離和分析。1975年美國Dow化學(xué)公司的H.Small等人

5、首先提出了離子交換分離抑制電導(dǎo)檢測分析思維即提出了離子色譜這一概念離子。色譜概念一經(jīng)提出便立即被商品化產(chǎn)業(yè)化由Dow公司組建的Dionex公司最早生產(chǎn)離子色譜并申請了專利。我國從20世紀80年代開始引進離子色譜儀器，在我國八五、九五科技攻關(guān)項目中均列有離子色譜國產(chǎn)化的項目，對其進行了重點技術(shù)攻關(guān)。色譜的分類色譜的分類有多種，主要按兩相的狀態(tài)及應(yīng)用領(lǐng)域的不同可分為兩大類1.按應(yīng)用領(lǐng)域不同分類制備色譜半制備色譜2.以流動相和固定相的狀態(tài)分類氣相色譜、氣固色譜、氣液色譜、液相色譜、液固色譜、液液色譜、超臨界色譜、毛細管電泳離子交換色

6、譜離子色譜分離主要是應(yīng)用離子交換的原理，采用低交換容量的離子交換樹脂來分離離子。它在離子色譜中應(yīng)用最廣泛，其主要填料類型為有機離子交換樹脂，以苯乙烯二乙烯苯共聚體為骨架在苯環(huán)上引入磺酸基形成強酸型陽離子交換樹脂，引入叔胺基而成季胺型強堿性陰離子交換樹脂，此交換樹脂具有大孔或薄殼型或多孔表面層型的物理結(jié)構(gòu)以便于快速達到交換平衡。離子交換樹脂耐酸堿，可在任何pH范圍內(nèi)使用，易再生處理，使用壽命長。缺點是機械強度差，易溶脹，易受有機物污染。離子色譜基本流程圖如下圖所示：離子交換的分類及常見種類（一）分類離子交換劑分為兩大類，即陽離子

7、交換劑和陰離子交換劑。各類交換劑根據(jù)其解離性大小，還可分為強、弱兩種，即強酸劑　陽離子交換劑　弱酸劑　強鹼型　陰離子交換劑　弱鹼型。1.陽離子交換劑　　陽離子交換劑中的可解離基因是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、羧酸（COOH）和酚羥基（-OH）等酸性基。某些交換劑在交換時反應(yīng)如下：強酸性：R-SO3-H+＋Na+R-SO3-Na+H+弱酸性：R-COOH＋Na+R-COONa＋H+國產(chǎn)樹脂中強酸1×7（上海樹脂＃732）和國外產(chǎn)品Dowex50、Zerolit225等都于強酸型離子交換劑。2.陰離子交換

8、劑　　陰離子交換劑中的可解離基因是伯胺、（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺[N-（CH3）2]和季胺[-N（CH3）2]等鹼性基團。某些交換反應(yīng)如下：強鹼性：R-N+（CH3）2H·OH-＋ClR-N+（CH3）2Cl＋OH-弱鹼性：R-N+（CH3）2H