原生質(zhì)體融合技術(shù)文獻(xiàn)綜述

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1、XXXX學(xué)校XXXXXX學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)文獻(xiàn)綜述學(xué)生姓名:學(xué)號(hào):專業(yè):生物工程班級(jí):設(shè)計(jì)(論文)題目:指導(dǎo)教師:二級(jí)學(xué)院:2010年月日題目學(xué)生:學(xué)號(hào):班級(jí):導(dǎo)師:摘要:原生質(zhì)體融合技術(shù)是細(xì)菌遺傳育種的有效方法之一,發(fā)展迅速,應(yīng)用廣泛.文中綜述了親本菌株選擇性遺傳標(biāo)記方法、影響原生質(zhì)體制備與再生因素、原生質(zhì)體融合方法和條件。介紹了原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物遺傳育種中的應(yīng)用,并展望了原生質(zhì)體融合技術(shù)的發(fā)展前景。關(guān)鍵詞:原生質(zhì)體融合種間融合選育引言:原生質(zhì)體融合也稱細(xì)胞雜交、細(xì)胞融合或體細(xì)胞雜交,是指細(xì)胞通過(guò)介導(dǎo)和培養(yǎng),在離體條件下用人工方法將不同種的細(xì)胞通

2、過(guò)無(wú)性方式融合成一個(gè)核或多核的雜合細(xì)胞的過(guò)程[1]。原生質(zhì)體融合技術(shù)起源于20世紀(jì)60年代。1960年法國(guó)的Karski研究小組在兩種不同類型的動(dòng)物細(xì)胞混合培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了自發(fā)融合現(xiàn)象。1974年匈牙利的FerenczyL等[2]采用離心力誘導(dǎo)的方法,報(bào)道了白地霉?fàn)I養(yǎng)缺陷型突變株的原生質(zhì)體融合,從而使原生質(zhì)體融合技術(shù)成為微生物育種的一項(xiàng)新技術(shù),并從微生物種內(nèi)融合擴(kuò)展到界間的融合。路玲玲等[3]采用融合技術(shù)成功構(gòu)建耐高溫高產(chǎn)酒精酵母,至此,原生質(zhì)體融合技術(shù)成為工業(yè)菌株改良的重要手段之一。原生質(zhì)體融合技術(shù)已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域取得了開(kāi)創(chuàng)性的研究成果,而且應(yīng)用領(lǐng)

3、域不斷擴(kuò)大[4]。1原生質(zhì)體融合技術(shù)微生物原生質(zhì)體融合技術(shù)的整個(gè)過(guò)程包括:原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體再生[5]。1.1 原生質(zhì)體制備與再生過(guò)程中的影響因素制備原生質(zhì)體的最大障礙就是細(xì)胞壁,現(xiàn)在去除細(xì)胞壁的主要方法是使用酶法,使用的酶主要為蝸牛酶或溶菌酶,具體根據(jù)所用微生物的種類而定。影響原生質(zhì)體制備的因素很多,不同的微生物有其較為適當(dāng)?shù)男纬蓷l件。在菌齡選擇上,多采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的細(xì)菌,這主要是由于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量最低,細(xì)胞壁對(duì)酶的作用最敏感。王燕[6]對(duì)雙親滅活米曲霉進(jìn)行原生質(zhì)體制備的過(guò)程中,用纖維素酶、溶壁酶、蝸牛酶混合濃

4、度為5∶3∶1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物產(chǎn)生的酶復(fù)合物或商品酶的混合液比單獨(dú)使用一種酶的效果好,在一定范圍內(nèi),酶作用的時(shí)間和酶作用的濃度都與原生質(zhì)體的形成率成正相關(guān),而與再生率成反相關(guān)。另外,EDTA作為螯合劑,可以避免金屬離子對(duì)酶的抑制作用而提高酶脫壁效果,從而提高原生質(zhì)體的形成率。據(jù)報(bào)道,對(duì)大腸埃希菌來(lái)說(shuō),用EDTA洗滌后,可以除去對(duì)酶解不利的金屬離子[7]。另一方面,在原生質(zhì)體制備前,用適量的青霉素對(duì)菌體進(jìn)行預(yù)處理,可以抑制肽聚糖合成過(guò)程中的轉(zhuǎn)肽作用,有利于原生質(zhì)體的形成。根據(jù)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理,酶解溫度直接影響酶促反應(yīng)的速度,如放線菌的

5、最適酶解溫度為28℃~37℃,真菌的最適酶解溫度為30℃~35℃[8]。在高滲Tris溶液中添加15mL/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等原生質(zhì)體擴(kuò)張劑,有利于溶液中細(xì)菌的分散,有助于制備原生質(zhì)體,添加0.02mol/L鎂離子,有利于原生質(zhì)體的穩(wěn)定。關(guān)于原生質(zhì)體的再生,吳孔興等[9]報(bào)道在原生質(zhì)體高滲再生培養(yǎng)基中加入0.3mol/L的蔗糖和0.2mol/L的丁二酸鈉是合適的,王玉華等[10]報(bào)道在高滲再生培養(yǎng)基中加入0.5mol/L的蔗糖是適宜的,這可能要根據(jù)不同的微生物種類而定。1.2 原生質(zhì)體融合過(guò)程中的影響因素1974年,匈牙利的Ferenczy報(bào)道了離

6、心力誘導(dǎo)法對(duì)白地霉?fàn)I養(yǎng)缺陷型突變株的原生質(zhì)體融合。隨后人們相繼用NaCl、KCl和Ca(NO3)2等作為誘變劑進(jìn)行融合,但融合頻率都很低。聚乙二醇在適量Ca2+存在下能有效地誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合,Ca2+主要是通過(guò)維持膜結(jié)構(gòu)的完整性來(lái)實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體的穩(wěn)定性與活性。原生質(zhì)體膜外在蛋白上二價(jià)陽(yáng)離子的存在使膜脂流動(dòng)性減慢、穩(wěn)定性增強(qiáng),這種維持穩(wěn)定性的效果大小與膜表面分子數(shù)量的多少呈正比例關(guān)系,PEG種類對(duì)原生質(zhì)體融合的影響不大。此外,其融合率還受其他諸因素的影響。影響原生質(zhì)體融合的因素很多,特別是環(huán)境中的陽(yáng)離子存在,融合時(shí)的pH也對(duì)原生質(zhì)體融合有較明顯的影響。一般

7、來(lái)講Ca2+、Mg2+有助于融合。如有0.01mol/LCa2+存在時(shí),可得到較高的融合率,但在缺乏鈣離子時(shí),若pH較低,融合頻率也較高。這是因?yàn)殁}離子和帶負(fù)電荷的PEG與細(xì)胞膜表面分子相互作用,使原生質(zhì)體帶電,彼此易于附著發(fā)生凝集所致[11]。2 原生質(zhì)體融合的方法2.1 PEG結(jié)合高Ca2+誘導(dǎo)法聚乙二醇(PEG)是一種多聚化合物,不同種類微生物對(duì)PEG分子質(zhì)量的要求不盡相同。放線菌適用分子質(zhì)量常為1ku~1.5ku,也有人使用0.4ku~6ku,真菌一般采用4ku~6ku,細(xì)菌用1.5ku~6ku。親本原生質(zhì)體制備好后,即可進(jìn)行融合。關(guān)于促融機(jī)制,一

8、般認(rèn)為PEG本身是一種特殊的脫水劑,它以分子橋形式在相鄰原生質(zhì)體膜

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