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《真菌原生質體融合技術》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、大型真菌原生質體融合技術研究進展1發(fā)展史由于原生質體技術的形成，去除了細胞壁的障礙，使得種內、種間甚至屬間雜交成為可能。原生質體融合起源于60年代，而真菌原生質體融合的第一篇報道是以白地霉(GeotrichumcandidumLink)營養(yǎng)缺陷型突變株為材料，采用離心方法進行原生質體融合，其融合率低于10-6。之后，人們又利用一些化學試劑，如NaNO2，Ca(NO3)2，NaCl，KCl等進行融合，效果得到改進。1976年安(Ann)等把用聚乙二醇(PEG)誘導植物原生質體融合的方法引入到真菌原生質體的融合中來，使融合率達
2、到10-2量級。PEG誘導原生質體融合的成功，推動了真菌原生質體融合的發(fā)展。1979年匈牙利的佩斯蒂(Pesti)首先報道了融合育種提高青霉素產(chǎn)量，從而開創(chuàng)了原生質體融合在實際工作中的應用。日本、英國、加拿大、中國等對雙孢蘑菇、香菇、木耳、平菇等食用菌原生質體的分離、再生、融合做了大量卓有成效的工作。在過去的幾十年中，人們已從54種食用菌中分離到原生質體；已進行了種內10種、種間19種，屬間5種、目間3種的原生質體融合研究。然而PEG等化學方法誘導原生質體融合對細胞損傷大，有殘留毒性。1979年森達(Senda)，1980
3、年齊默爾曼(Zimmermann)等人報道了電場誘導細胞融合的新技術，電融合技術操作簡單、無化學毒性，對細胞損傷小，融合率高。以后幾年里，人們把這種新的融合手段從動、植物擴展到微生物的原生質體融合研究中，導致了原生質體融合技術的新突破。1988年張聞迪等又報道了激光誘導動物細胞融合。1998年又有報道螯合劑對原生質體融合具有促進作用。2原生質體融合中親本的選擇標記原生質體融合前首先必須對親本進行遺傳標記，從而有利于挑選融合子。在融合中，可采用營養(yǎng)缺陷型、抗藥性、滅活原生質體、熒光染色、形態(tài)差異和自然生態(tài)標記等方法。2．1營
4、養(yǎng)缺陷型標記營養(yǎng)缺陷型標記是一種傳統(tǒng)有效而直接的方法。它是通過誘變篩選進行的，菌絲、分生孢子、擔孢子及原生質體都可用作誘變材料。選擇的誘變材料與使用的誘變劑相適應容易獲得較高的突變率，使用能直接改變DNA結構的化學誘變劑，一般選擇孢子為誘變材料，若選用堿基類似物的誘變劑，宜選擇已萌發(fā)的單核菌絲或經(jīng)孵育的孢子進行誘變處理；而對于已萌發(fā)的孢子、菌絲和原生質體用紫外線進行誘變較好?，F(xiàn)已從糙皮側耳，鮭黃側耳、桃紅平菇、毛木耳、光木耳和琥珀木耳等獲得了不同的營養(yǎng)缺陷型。營養(yǎng)缺陷型標記雖較費時費力，且會使親本的優(yōu)良性狀喪失或降低，但它
5、仍是育種研究工作中重要一部分，只要誘變和選擇方法適當，是可選擇出具有正突變的營養(yǎng)缺陷型的。2．2抗藥性標記微生物抗藥性是其菌種的特性，是由遺傳物質決定的，不同的微生物對某一種藥物的抗性存在差異。1984年布拉德肖(Bradshaw)和佩貝迪(Peberdy)首先利用這種方法在Apergillusnidulans和A.regulosus融合中選擇出了融合子。這種不通過誘變而得到的抗藥性標記是選擇標記的一個較好途徑。且這種抗藥性在遺傳上也十分穩(wěn)定。若無自然抗藥性標記，則可以通過各種誘變手段而獲得抗藥性。用雙親抗藥性差異選擇融合
6、子時，要掌握好藥物的濃度，濃度過高會使融合頻率降低，過低會使親本生長，而影響融合子的檢出。2．3滅活原生質在融合中滅活1個親株的原生質體與另一親株的原生質體融合，被滅活的親株可不加任何遺傳標記，只需對活菌株進行標記，這樣大大減少融合前親株進行遺傳標記的工作量，潘迎捷等人已對香菇屬中的不同種進行滅活獲得成功。其中化學滅活和熱滅活效果都達100%。2．4熒光染色在酶解制備原生質體時向酶液中加入熒光色素，使雙親原生質體分別帶上不同的熒光色素，帶上熒光色素的原生質體仍能發(fā)生融合并具再生能力。2．5形態(tài)標記這是利用四極性異宗配合的食
7、用菌進行的種內原生質體融合。采用以單核體作親本，以融合后異核體形成鎖狀聯(lián)合作為篩選標記，這樣可省去在融合前對親株進行標記的大量工作，潘迎捷等應用此方法構建了數(shù)百株不同組合的香菇種內原生質體融合子，而且其中有些融合子表現(xiàn)出較好的生產(chǎn)性狀。2．6自然生態(tài)標記真菌的不同種、屬之間及種內，由于起源的地理區(qū)域和生態(tài)環(huán)境不同，經(jīng)長期的進化選擇，每個種都形成了獨特的對生態(tài)和生理環(huán)境的適應性且具有明顯特點。這些生態(tài)指標的差異為我們進行融合提供了很好的生態(tài)標記性狀。3原生質體的制備及再生3．1原生質體的制備3．1．1影響原生質體制備的因素制
8、備食用菌原生質體的材料可以是菌絲、子實體、孢子。在制備過程中，原生質體的產(chǎn)率常受以下幾方面的影響。3．1．1．1菌齡制備原生質體多采用菌絲作為材料，鮮嫩菌絲分離原生質體的產(chǎn)率高、活力強，易于再生，一般以3～5日或5～7日為宜。菌齡太短生成的菌絲量少，影響原生質體形成率，菌齡過大形成的原生質體小且變形多，
