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1、鹽法提取菠蘿蛋白酶的研究張桂香王元秀矯強(qiáng)石玉寶濟(jì)南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院生物技術(shù)系濟(jì)南,250022摘要：論文采用正交實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用鹽析法從菠蘿皮中提取菠蘿蛋白酶，對(duì)菠蘿蛋白酶的提取工藝及其影響因素進(jìn)行了研究，并對(duì)提取后得到的菠蘿蛋白酶進(jìn)行測(cè)定。關(guān)鍵詞：菠蘿皮、菠蘿蛋白酶、正交實(shí)驗(yàn)、鹽析法前言：酶的應(yīng)用已有幾千年的歷史。特別是近30來(lái)，隨著酶生產(chǎn)的不斷發(fā)展，酶已廣泛地用于食品、輕工、醫(yī)藥、環(huán)保以及科技等領(lǐng)域。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的酶約有3000種，但現(xiàn)在已應(yīng)用的酶不足十分之一，而已工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的酶不過(guò)幾十種[1]。菠蘿蛋白酶就是其中的一種酶，它存在于菠蘿家族之中，它不僅存在于芽中，
2、而且也存在于果實(shí)之中。通過(guò)壓榨芽殖細(xì)胞，用丙酮、NaCl或(NH4)2So4使沉淀物凝固的辦法可獲取菠蘿蛋白酶[2]。一般提取用的酶源是鳳梨，但是價(jià)格較貴，約6000元/噸。而用菠蘿皮，不但可以減少資源的浪費(fèi)，降低費(fèi)用，又能減少環(huán)境的污染。對(duì)于菠蘿蛋白酶來(lái)說(shuō)，使用鹽析法提取是比較理想的一種方法，也使用的最廣泛，其基本原理是：不同的蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中溶解度不同而能分離。此法簡(jiǎn)便、安全[3]。1、材料與設(shè)備1.1材料與試劑菠蘿皮：市場(chǎng)采集；高嶺土、酪蛋白：化學(xué)純pH試紙：山師化工廠；其它試劑均為分析純1.2儀器與設(shè)備電子恒溫水浴鍋：DZKW-C型，黃驊市卸甲綜合電器
3、廠數(shù)顯溫控儀（電熱恒溫培養(yǎng)箱）：ZJYY-XMT-142，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠離心機(jī)：LG10-2.4A型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠高速組織搗碎機(jī)：Ds-1，上海標(biāo)本模型廠制造架盤(pán)藥物天平：Hc-TP11-1型，上海第二天平儀器廠722光柵分光光度計(jì):上海第三分析儀器廠2、實(shí)驗(yàn)方法2.1菠蘿蛋白酶的提取方法2.1.1工藝流程[4-5]菠蘿皮洗凈→去雜→搗碎過(guò)濾→[濾液濾渣→乙醇→浸提液→過(guò)濾→濾液]→加苯甲酸鈉→壓出液→10℃加白陶土→吸附物→加(NH4)SO4調(diào)pH6.5-7→洗脫液→正交實(shí)驗(yàn)方法otherstaffoftheCentre.Duringthewar,Zhuwa
4、stransferredbacktoJiangxi,andDirectorofthenewOfficeinJingdezhen,JiangxiCommitteeSecretary.Startingin1939servedasrecorderoftheWestNorthOrganization,SecretaryoftheSpecialCommitteeAfterthevictoryofthelongMarch,hehasbeentheNorthwestOfficeoftheFederationofStateenterprisesMinister,ShenmufuguS
5、ARmissions,DirectorofNingxiaCountypartyCommitteeSecretaryandrecorderoftheCountypartyCommitteeSecretary,Ministersand3→粗制品→溶解→NaOH調(diào)pH→待測(cè)液。2.1.2流程說(shuō)明2.1.2.1濾液制備：選取干凈的菠蘿皮，除雜，在清水中漂洗三次，瀝干，放入冰箱冷凍備用。用高速組織搗碎機(jī)打漿，過(guò)濾，取濾液，濾渣加入乙醇進(jìn)行第二次浸提、過(guò)濾，合并兩次濾液，按汁加0.05%苯甲酸鈉作防腐劑，送入冰箱存放備用。2.1.2.2吸附、洗脫：壓出汁液置不銹鋼保溫缸中，不斷攪
6、拌，加入汁液量的4%白陶土，在10℃吸附15-20分鐘，靜置過(guò)夜，次晨虹吸除去上清液，留下濕陶土，加入Na2CO3飽和液調(diào)節(jié)pH6.5-7，再加入按濕土計(jì)50%的(NH4)4So4，攪拌25-30分鐘，進(jìn)行洗脫。2.1.2.3待測(cè)酶液制備:將上述洗脫液分別離心兩次，取沉淀，溶解.按正交試驗(yàn)要求，加入食鹽沉淀（鹽析），5分鐘后，離心，棄上清液，洗滌沉淀，過(guò)濾，定容。2.2菠蘿蛋白酶測(cè)定方法:C.D.U.方法[5]2.3菠蘿蛋白酶鹽析實(shí)驗(yàn)方法:利用L25(56)正交設(shè)計(jì)表[6]表1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表因素水平NaCl添加量（%）（A）溶液pH值（B）沉淀溫度(℃)（C）1144
7、02185103226154267205308253、結(jié)果與討論3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法，測(cè)定三次，取平均值,計(jì)算一元線性回歸方程為A=0.0091x+0.03736,其中，A:吸光度，x：未消化酪蛋白的量。3.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果從菠蘿皮中按正交實(shí)驗(yàn)提取蛋白酶，并采用測(cè)定C.D.U方法分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2。由表2可以看出，影響酶提取的影響因素主次順序?yàn)锽>A>C，最優(yōu)組合為A1B4C1,即：NaCl的量14%，溶液的pH值7，沉淀溫度為0℃為最佳。表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)號(hào)因素酶含量ABC111116.093212223.4793133
