菠蘿蛋白酶的提取、分離純化與活性測定

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1、菠蘿蛋白酶的提取、初步分離純化及活性測定15食安（1）班張凱摘要：本研究運用硫酸銨沉淀法和透析法并結合考馬斯亮藍G520染色法測定菠蘿皮中蛋白酶活性及蛋白質含量，得到同一品種及成熟度的菠蘿皮經兩種不同的純化方法處理，菠蘿皮中的蛋白酶都能被有效純化，但是蛋白酶活性會損失一部分。關鍵詞：菠蘿蛋白酶；透析法；分離純化；酶活性；前言菠蘿蛋白酶(bromelain)是從菠蘿植株中提取的一類蛋白水解酶的總稱,主要存在于菠蘿莖和果實中,根據提取部位的不同,分為莖菠蘿蛋白酶和果菠蘿蛋白酶。Marcano于1891年研究發(fā)現菠蘿汁中含有蛋白酶。隨后,人們對菠蘿蛋白酶展開

2、了一系列研究,發(fā)現其在醫(yī)藥和化工領域有很好的利用價值。1957年,Heineche等從菠蘿莖中提取得到蛋白質水解酶,從而使菠蘿蛋白酶實現商品化生產。目前,菠蘿蛋白酶的一些功能成分已得到成功分離,并應用于醫(yī)藥領域。隨著提取純化技術的不斷進步,高活性的菠蘿蛋白酶將廣泛應用于醫(yī)藥、化工和食品領域。[1]利用菠蘿皮分離純化菠蘿蛋白酶，不僅可充分利用資源，拓展菠蘿蛋白酶的獲取途徑和應用空間，還可降低菠蘿加工廢料對環(huán)境的污染；隨著市場對菠蘿加工產品需求量的增大，對于菠蘿皮的研究與利用就顯得尤為重要，尤其對最主要的功能成分蛋白酶的分離、純化與性質的研究更有意義。[2

3、]本文通過對菠蘿皮蛋白酶的提取，初步分離純化及活性測定進行了初步研究，探討影響菠蘿蛋白酶活性的影響因素，并解決實驗存在的一些問題。1實驗材料與儀器1．1實驗材料與試劑新鮮菠蘿，透析袋（截留相對分子質量8000~14000），0.1mo1/LpH7.8磷酸緩沖液配制（PBS），0.01mo1/LpH7.8磷酸緩沖液配制（PBS），1％酪蛋白，激活劑[含20mmo1／L半胱氨酸-鹽酸鹽、1mmo1/LEDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)]，10％三氯乙酸(TCA)。1．2實驗儀器722型可見光分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；752型光柵分光光度計

4、：北京光學儀器廠；TDL-60B臺式離心機：上海安寧科學儀器廠；D5M離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；可控硅恒溫水浴鍋：上海錦屏儀器儀表有限公司；AMPUT電子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京賽多利斯天平有限公司；DS-1型高速組織搗碎機：上海標本模型廠；HZS-H型水浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司。2實驗方法2.1菠蘿蛋白酶的粗酶提取稱取菠蘿皮材料20g，將菠蘿皮在清水中洗凈，瀝干，切成小段后置于超高速攪拌機中，加入約60mL預冷的0.1mo1/LpH7.8PB

5、S，持續(xù)攪拌10~15min至粉碎，攪拌完成后用4層紗布過濾，得到濾液后，用冷凍離心機于4°C3000rpm離心6min，棄沉淀，即得到菠蘿蛋白酶粗提液，測定粗提液的體積、蛋白質含量和酶活性。2.2鹽析-，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固體硫酸銨，邊加邊攪拌，使溶液最終硫酸銨飽和度為30%，放置于冰水混合物（4℃）30min后，酶蛋白沉淀析出，4°C4000rpm離心10min，收集沉淀，加入0.1mo1/LpH7.8PBS約15mL至完全溶解，測定其體積、蛋白質含量和酶活性。2.3透析將溶解液裝入2.5cm×8cm透析袋（預先將透析袋在蒸餾

6、水中煮沸30min）中，于500mL燒杯中，在磁力攪拌器攪拌下用蒸餾水透析，15min換水一次，換水3～4次后，檢查SO42-是否已被除凈（檢查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支試管，滴加2～3滴透析外液至試管中，若出現白色沉淀，表示SO42-未除凈，若無沉淀出現，表示透析完全）。若透析液有沉淀，將透析液用濾紙過濾，測定過濾液的體積、蛋白質含量和酶活性。2.4酶活力測定方法取2支試管，設置一支為實驗對照，三支為平行樣品。取0.1mL酶液，加入0.9mL激活劑，加入37℃預熱的1%酪蛋白溶液1mL，準確反應10min，加入10%三氯乙酸3mL反應終

7、止酶反應。對照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它與測定管相同。離心（3000r/min，5min）或過濾，清液于280nm波長下測定光吸收值。酶活單位定義：在上述條件下，每10min增加0.001個光吸收值為1個酶單位（U）。實驗步驟按照表格中完成。表1酶活測定步驟試劑(ml)對照組平行樣品1平行樣品2平行樣品3TCA3———酶液0.10.10.10.1激活劑0.90.90.90.9酪蛋白111137°C準確反應10minTCA—333A280nmOD值粗提—0.7910.8180.868鹽析—0.8230.9070.986透析—0.89

8、40.8750.8482.5蛋白質含量測定方法將酶液稀釋至一定程度，采用考馬斯亮蘭G-250法