腫瘤抑制基因DOC2真核表達載體的構(gòu)建及在卵巢癌細胞HO8910中的表達鑒定.doc

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1、腫瘤抑制基因DOC2真核表達載體的構(gòu)建及在卵巢癌細胞HO8910中的表達鑒定作者：劉淑娟，韓軍濤，辛曉燕，吳元明，陳蘇民【摘要】　　目的構(gòu)建腫瘤抑制基因DOC2的真核表達載體pCDNA3.1p93，將其轉(zhuǎn)入人卵巢癌細胞系HO8910中，對其基因表達進行相關(guān)檢測，為進一步研究DOC2的功能奠定基礎(chǔ)。方法利用XhoI酶切含有p93cDNA的質(zhì)粒得到p93cDNA基因片段，將其連接入真核表達載體pCDNA3.1，并通過酶切鑒定。用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將真核表達載體pCDNA3.1p93轉(zhuǎn)染HO8910，通過G418篩選穩(wěn)定表達克

2、??；用免疫組化法觀察人DOC2蛋白在HO8910中的表達。結(jié)果構(gòu)建了DOC2的真核表達載體pCDNA3.1p93，并通過酶切鑒定。免疫細胞化學結(jié)果顯示pIRES2EGFPp93成功轉(zhuǎn)入HO8910中。結(jié)論成功構(gòu)建了真核表達載體pCDNA3.1p93并在HO8910中得到穩(wěn)定表達，為研究DOC2蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】DOC2　真核表達載體　卵巢癌　　ConstructionofTheEukaryoticExpressionVectorpCDNA3.1p93andItsExpressioninOvar

3、ianCancerCellLineHO8910　　Abstract：ObjectiveToconstructanrecombinantvectorconsistedofpCDNA3.1withDOC2cDNA(p93)andtransfectitintohumanovariancancercelllineHO8910inordertoinvestigatethefunctionofDOC2geneonovariancancercell.MethodsTherecombinantvector(pCDNA3.1p93)was

4、constructedbyXhoIanditscorrectionwasconfirmedbyrestrictionpattern.ThenpCDNA3.1p93wastransfectedintoHO8910byLipofectaminandthepositiveclone8910p93and8910pCDNA3.1wereselectedbyG418.Finally,theexpressionofDOC2in8910p93wasprovedbyimmuncytochemicalmethod.ResultsThere

5、combinantvectorpCDNA3.1p93wasconstructedsuccessfully.AfterbeingtransfectedintoHO8910,thepCDNA3.1p93positiveclonecouldbeharvestedbyG418andthesteadyexpressionofproteinDOC2wasconfirmedbyimmuncytochemicalmethod.ConclusionAftertherecombinantvectorpCDNA3.1p93beingconst

6、ructed,DOC2genecouldexpresssteadilyinHO8910.ThiswillallowustostudythefunctionofDOC2geneinfuture.　　Keywords：DOC2;Eukaryoticexpressionvector;Ovariancancer　　0引言5　　卵巢癌是婦科腫瘤中最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病機制與抑癌基因的關(guān)系一直是該領(lǐng)域研究的熱點[1]。1994年Mok等[2]在研究人正常卵巢上皮細胞與卵巢癌細胞的基因差異表達時，發(fā)現(xiàn)該基因在正常卵巢上皮細胞中有表達，

7、而在卵巢癌細胞系及組織中無表達，故將其命名為DOC2（Differentiallyexpressedinovariancancer2）。人類DOC2位于染色體5p13，長約35kb，含有15個外顯子和14個內(nèi)含子，cDNA共3268bp，編碼長度為770個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量約為82.5KDa[3]。DOC2是具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的新的磷蛋白，它能抑制多種腫瘤細胞的生長，被認為是一種可能的腫瘤抑制基因，但其作用機制尚未完全闡明。本研究中，我們構(gòu)建了含有DOC2cDNA（p93）的真核表達載體，并轉(zhuǎn)染人卵巢癌細胞系HO891

8、0，為研究DCO2在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)?！　?材料和方法　　1.1材料質(zhì)粒pCDNA3.1(-)由本校生化教研室陳蘇民教授惠贈；含有人DOC2cDNA的質(zhì)粒p93由美國Dr.XuXiangxi惠贈；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒（Lipofecta