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《人線粒體融合蛋白―2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定.doc》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、人線粒體融合蛋白一2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定摘要：目的構(gòu)建人線粒體融合蛋白-2(mitofusin-2,MFN2)基因真核表達(dá)載體并對其進(jìn)行鑒定。方法在pEGFP-Nl載體多克隆位點(diǎn)插入人MFN2基因編碼區(qū)序列，酶切、測序驗(yàn)證是否插入及正確性。將所構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的人血管平滑肌細(xì)胞(Vascularsmoothmusclecells,VSMCs),熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá);熒光定量PCR和Westernblot分別檢測MFN2的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果成功構(gòu)建了人MFN2基因真核表達(dá)載體，其轉(zhuǎn)染VSMCs后，可以檢測到MFN2mRNA及蛋白水平高表達(dá)(P〈0.01)。結(jié)
2、論成功構(gòu)建了人MFN2基因真核表達(dá)載體，且能夠在原代VSMC中過表達(dá)。關(guān)鍵詞：線粒體融合蛋白-2；載體構(gòu)建；鑒定血管平滑肌細(xì)胞(Vascularsmoothmusclecells,VSMCs)的增殖是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)形成的中心環(huán)節(jié)。線粒體融合蛋白-2(mitofusin-2,MFN2)是一種細(xì)胞增殖抑制因子，能抑制VSMCs增殖［1,2］。本研究擬通過構(gòu)建人MFN2基因真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染原代人臍靜脈平滑肌細(xì)胞，熒光定量PCR法及Westernblot檢測MFN2mRNA及蛋白表達(dá)，為今后研究MFN2在AS中的作用打下良好基礎(chǔ)。1資料與方法1.
3、1一般資料原代人臍靜脈平滑肌細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自Hyclone公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5a購自北京博邁德生物科技公司；真核基因表達(dá)載體pEGFP-Nl購自Clontech公司；TaqDNA聚合酶購自寶生物公司；限制性內(nèi)切酶BglII及EcoRI、T4DNA連接酶均購自Fermentas公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自Fennentas公司；TRIzol試劑、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；兔抗人MFN2抗體購自北京博奧森生物科技有限公司。1.2方法1.2.1原代細(xì)胞人臍靜脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定采用于
4、海嬌［3］等方法培養(yǎng)及鑒定原代培養(yǎng)的人臍靜脈平滑肌細(xì)胞。1.2.2人MFN2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建在NCBI網(wǎng)站查找人MFN2mRNA編碼區(qū)序列，并設(shè)計(jì)引物。上游引物：5’-GAAGATCTATGTCCCTGCTCTTCTCTCGAT-3’；下游引物：5，-GGAATTCTCTGCTGGGCTGCAGGTACT-3，，上下游引物分別引入Bglll及EcoRI酶切位點(diǎn)（以下劃線標(biāo)出）。TRIzol法提取人臍靜脈平滑肌細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增；膠回收進(jìn)行酶切-連接后轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，提取質(zhì)粒經(jīng)Bglll及EcoRI雙酶切及測序鑒定。測序正確者命名為pEGFP-M
5、FN2。1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染將細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合60%?80%時，設(shè)置pEGFP-Nl空質(zhì)粒對照組及PEGFP-MFN2轉(zhuǎn)染組，每組設(shè)三個復(fù)孔。按照Lipofectamine2000說明書步驟進(jìn)行，轉(zhuǎn)染各組后371細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，6h后更換完全培養(yǎng)液。48h后用熒光顯微鏡觀測各組細(xì)胞綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況。1.2.4熒光定量PCR檢測MFN2mRNA的表達(dá)提取轉(zhuǎn)染PEGFP-MFN2細(xì)胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行熒光定量PCRo以GAPDH為內(nèi)參照，根據(jù)PCR儀自動生成的Ct值，根據(jù)公式：目的基因的相對量=2-AACt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。
6、1.2.5westernblot檢測MFN2蛋白的表達(dá)按照全蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2h,分別用抗MFN2和抗3-actin抗體孵育過夜，TBST洗膜；辣根過氧化物酶(1：3000)室溫標(biāo)記1h,TBST洗膜；X光膠片曝光、顯影、定影。照像并分析，以3-actin蛋白為內(nèi)參，用MFN2與0-actin條帶像素灰度的比值表示MFN2蛋白的相對表達(dá)量。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果以表示，應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3討論MFN2是近年發(fā)現(xiàn)的具有許多生物學(xué)功能的
7、蛋白，在VSMCs以及心、腎等組織中廣泛分布［4］。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓大鼠、球囊損傷大鼠和ApoE基因敲除小鼠的VSMCs中Mfn2表達(dá)均明顯下調(diào)。我國學(xué)者陳光慧等［1］首次發(fā)現(xiàn)MFN2基因控制VSMCs增殖，其機(jī)制主要在于MFN2是原癌基因Ras的直接負(fù)調(diào)控因子，能夠與其相互作用，阻滯Ras-Raf-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而將細(xì)胞周期阻斷在G0/G1期。研究還發(fā)現(xiàn)，血管緊張素II、內(nèi)皮素-1及IL-1等可以通過下調(diào)MFN2表達(dá)，促進(jìn)VSMCs的增殖，而相應(yīng)的
