龍血竭對組織工程皮膚修復(fù)皮膚缺損的作用.doc

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1、龍血竭對組織工程皮膚修復(fù)皮膚缺損的作用作者：劉愛軍朱永紅趙鐘祥張立群杜標(biāo)炎鄺棗園李彩霞易華【摘要】　　[目的]觀察龍血竭對組織工程皮膚修復(fù)皮膚缺損創(chuàng)面的促進(jìn)作用。[方法]將人成纖維細(xì)胞種植入膠原海綿，人角質(zhì)形成細(xì)胞種植在表層，構(gòu)建組織工程皮膚，并移植入裸鼠皮膚缺損創(chuàng)面;實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為4組，選用"活血圣藥"龍血竭于移植后2d分別進(jìn)行創(chuàng)面外敷、單純口服、創(chuàng)面外敷+口服治療，并設(shè)空白對照組。組織工程皮膚移植后9d取材檢測，觀察創(chuàng)面局部表皮厚度、真皮層中層粘連蛋白(Ln)、Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)及毛細(xì)血管增生情況。[結(jié)果]龍血竭能促進(jìn)組織工程皮膚移植后表皮的發(fā)育及真皮層

2、中毛細(xì)血管的增生,增強(qiáng)Ln、Ⅰ型膠原蛋白的分泌，龍血竭外敷+口服組效果最佳。[結(jié)論]龍血竭對組織工程皮膚修復(fù)皮膚創(chuàng)面有促進(jìn)作用。【關(guān)鍵詞】龍血竭/藥理學(xué)皮膚缺損/中西醫(yī)結(jié)合療法皮膚移植組織工程皮膚/病理學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)　　大面積的皮膚缺損需要皮膚移植進(jìn)行修復(fù)，皮源不足是最大的問題，許多患者往往因難以實(shí)現(xiàn)及時的救護(hù)，而導(dǎo)致感染、多器官功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥甚至死亡。組織工程皮膚是利用來源于自體或異體的皮膚細(xì)胞，與適宜的真皮支架復(fù)合，在體外構(gòu)建而成的皮膚類似物，將其移植入皮膚缺損創(chuàng)面，修復(fù)缺損的皮膚,為解決皮膚移植中的皮源不足問題提供了光明前景。但目前組織工程皮膚移植后存

3、在表皮層薄、血管化進(jìn)程慢等問題，導(dǎo)致移植成功率低[1]。　　祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療皮膚創(chuàng)傷方面有著悠久的歷史，"生肌法"是中醫(yī)藥治療皮膚創(chuàng)傷的一項重要治則，生肌中藥通過"收斂止血、活血化瘀、祛腐生肌"等作用修復(fù)缺損的皮膚。本研究將構(gòu)建的組織工程皮膚移植后，利用活血圣藥龍血竭作用于移植處，觀察創(chuàng)面微環(huán)境的變化，探討利用生肌中藥促進(jìn)組織工程皮膚修復(fù)創(chuàng)面的可能性，現(xiàn)報道如下?！　?材料與方法　　1.1主要材料高糖DMEM及低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(FBS，天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?;25cm2塑料培養(yǎng)瓶(Coning公司);胰蛋白酶及II型

4、膠原酶(均為Sigma公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。龍血竭購自廣州市杏園春大藥房;幼兒包皮取自中山一院兒外科無菌切除標(biāo)本(病人家屬知情);人角質(zhì)形成細(xì)胞購自中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動物中心;膠原海綿購自廣州市創(chuàng)爾生物技術(shù)有限公司。　　1.2實(shí)驗(yàn)動物SPF級裸鼠，雌雄不拘，體質(zhì)量約20g，購自本校實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：SCXK粵20030001，粵監(jiān)證字2007A015。4　　1.3免疫熒光試劑及儀器Ⅰ抗層粘連蛋白(Ln)(博士得生物試劑公司);Ⅰ型膠原(Sigma公司);Ⅱ抗為紅色熒光探針(Cy3)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(IgGCy3)，核標(biāo)記物為二脒基苯基

5、吲哚(DAPI)，均購自Sigma公司;IX71奧林巴斯倒置熒光顯微鏡(日本)?！　?.4實(shí)驗(yàn)方法　　1.4.1人皮膚細(xì)胞的培養(yǎng)取無菌切除術(shù)后幼兒包皮，于超凈工作臺上用含青霉素2×105U/L、鏈霉素200mg/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，盡可能剔除皮下組織，剪成約2mm×2mm小塊，置于1g/LⅡ型膠原酶消化液中消化過夜(4℃、約18h)，分離表皮和真皮。將真皮剪碎，然后轉(zhuǎn)移至2.5g/L胰蛋白酶中約15min，以含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，1000r/min離心3min，將沉淀物接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，以含體積分?jǐn)?shù)1

6、0%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液分離培養(yǎng)人包皮成纖維細(xì)胞。角質(zhì)形成細(xì)胞以含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)傳代。　　1.4.2組織工程皮膚的構(gòu)建將無菌的膠原海綿剪成1cm×1cm×0.2cm小塊，放入無菌24孔板內(nèi)，取第3～5代人包皮成纖維細(xì)胞，按1×105個/cm2將細(xì)胞種植于膠原海綿兩面，體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃靜置培養(yǎng)3～4h。將人角質(zhì)形成細(xì)胞以1×105個/cm2密度接種于單面膠原海綿，無菌培養(yǎng)3～4h。　　1.4.3組織工程皮膚的移植SPF級裸鼠用40mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉(按10mL/kg劑量)，固定于手術(shù)臺上，嚴(yán)格消毒后

7、，沿背部正中線左右距脊柱約0.5cm處皮膚呈"C"形切開，形成皮瓣，分離皮下組織至深筋膜，暴露肌層，切口大小約1cm2。將體外構(gòu)建的組織工程皮膚覆蓋到全層皮膚缺損的創(chuàng)面，再用無菌凡士林紗布覆蓋，單針縫線固定皮瓣于正常皮膚上，無菌紗布包扎。術(shù)后2d拆除敷料，剪掉皮瓣。單籠飼養(yǎng)?！　?.4.4實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為4組，每組4只，分為龍血竭外敷組(隔天換藥)、內(nèi)服(按70mg·kg-1·d-1劑量灌胃)組、外敷+內(nèi)服組，不用藥者為空白對照組。于術(shù)后9d取材檢測，單籠飼養(yǎng)?！　?.4.5免疫熒光檢測術(shù)后9d取材，連同周邊正常皮膚剪去稍許，4℃、40g/L多聚甲醛(

8、pH7.4)固定6～8h，300g/L