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《實時熒光定量pcr在臨床及科研中的應(yīng)用》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、實時熒光定量PCR在臨床及科研中的應(yīng)用主要內(nèi)容1234RealTimePCR用途及原理RealTimePCR幾種方法介紹RealTimePCR技術(shù)應(yīng)用RealTimePCR應(yīng)用實例差異顯示結(jié)果驗證定性分析絕對定量相對定量病毒和病原菌檢測基因芯片結(jié)果驗證siRNA效果確認mRNA表達量分析RealTimePCR用途操作簡單，無需電泳，檢測快速，降低污染幾率，適用于大量樣品檢測，檢測靈敏度高；可以在寬廣范圍內(nèi)進行準(zhǔn)確定量。生物品種鑒定病毒和病原菌定量分析導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析GMO定量檢測SNP解析激發(fā)光發(fā)射光Ct值RealTimePCR原理使用RealTime
2、PCR擴增裝置，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法RealTimePCR原理熒光閾值Threshold：突破背景熒光水平后的熒光值.閾限循環(huán)Ct：熒光信號達到閾值時的循環(huán)數(shù).突破Ct以后，熒光以指數(shù)形式增加,然后線性增加，并最終進入平臺期Ct值的特點：終點處產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性RealTimePCR原理定量PCR通過Ct和初時模板量的關(guān)系進行定量。同一樣品的96個重復(fù)的終點熒光強度差別很大，但是Ct相同。CycleC(t)RealTimePCR原理模板DNA量越
3、多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量。RealTimePCR檢測方法核酸染料技術(shù) 代表：SYBRGreenI(SGI)熒光探針技術(shù) 代表：TaqManprobeSYBRGreenI與dsDNA結(jié)合SGI與dsDNA結(jié)合后受激發(fā)熒光強度增加1000倍隨著產(chǎn)物的積累，越來越多的SGI與dsDNA結(jié)合，使得熒光信號增強.llllPCRReactionProgressionllllllllllllReal-TimePCR檢測原理(SY
4、BRGreenI法)SYBRGreenIPCR檢測的特點優(yōu)點僅需要一對引物，實驗設(shè)計簡單。擴增后可進行產(chǎn)物的熔解曲線分析，以確定特異性。實驗成本低。不足特異性僅由引物保證。非特異性雙鏈DNA也會產(chǎn)生熒光信號。不能用于多重Real-TimePCR。Real-TimePCR檢測原理(TaqManprobe法)TaqMan探針為一寡核苷酸:5’端標(biāo)記一個報告熒光基團(Reporter)，3’端標(biāo)記一個淬滅熒光基團(Quencher)。F490nm520nmRQQlRQRQ1.PCR過程中，探針與模板的特定序列結(jié)合2.DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性，將探
5、針?biāo)?，從而破壞熒光基團和淬滅基團之間的FRET3.照射報告基團發(fā)出可檢測的熒光信號R4.隨著PCR擴增的進行，熒光信號不斷積累Real-TimePCR檢測原理(TaqManprobe法)優(yōu)點靶標(biāo)特異的熒光信號高度的檢測特異性可用于多重Real-TimePCR不足探針合成成本高TaqManprobe法PCR檢測的特點SYBRGreenI法vsProbe法SYBRGreenI法優(yōu)點：價格便宜、使用方便、無需合成特異性探針。缺點：引物要求高(要求特異性擴增)、不能進行多重PCR。Probe法優(yōu)點：特異性強，能進行多重PCR。缺點：需要設(shè)計特異性探針，成本高、
6、有時設(shè)計困難。使用SYBRGreenI進行檢測的問題點●SYBRGreenI與雙鏈DNA進行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴增，非特異性DNA也將同時被檢測，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確?！馪rimerDimer的產(chǎn)生二條引物的3’端具有互補序列時，引物自身也會進行擴增，產(chǎn)生短鏈DNA片段（PrimerDimer）。3’3’5’5’5’5’3’3’GATC CTAGGATC CTAG使用SYBRGreenI進行定量PCR的KeyPointPrimer：設(shè)計合適引物，防止非特異性擴增，是使用SYBRGreenI進行定量PCR的KeyPoint。
7、RealTime進入SYBRGreenI時代設(shè)計合適的引物選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件使用良好的試劑保證以上條件，使用SYBRGreenI將會更加便宜，更為方便，并擁有良好的特異性。目的是獲得目的基因，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴格。目的是讓目的基因按照理論值進行擴增，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴格。RealTimePCR用引物與普通PCR引物設(shè)計要求不同=>對引物設(shè)計要求嚴格普通PCR引物RealTimePCR引物RealTimePCR引物及探針設(shè)計擴增片段大小★80-150bp(盡量限制在300bp以內(nèi))Primer長度★17-25baseGC含量★
8、40-60%(最好45-55%)Tm值★★★兩條引物的Tm值盡量接近，引用專用軟
