幾種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較

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1、幾種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較【摘要】：蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法(Biuret)、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法（Bradford），F(xiàn)olin—酚試劑法（Lowry）杜馬斯燃燒法。其中Bradford法靈敏度頗高，比紫外吸收法靈敏10～20倍,比Biuret法靈敏100倍以上。凱氏定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。過去Folin—酚試劑法法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以在本公司訂購(gòu)），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取

2、代。測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中全氮的凱氏定氮法在許多國(guó)家已被杜馬斯然燒定氮法所代替，杜馬斯燃燒法是基于在高溫下(大約900℃），通過控制進(jìn)氧量、氧化消解樣品的原理而進(jìn)行氮測(cè)定的。這6種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：⑴實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；⑵蛋白質(zhì)的性質(zhì)；⑶溶液中存在的干擾物質(zhì)；⑷測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間【關(guān)鍵詞】：凱氏定氮法　雙縮脲法紫外吸收法考馬斯亮藍(lán)法Folin—酚試劑法杜馬斯燃燒法一、凱氏定氮法1.1原理凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定4個(gè)過程。其原理是樣品中含氮有機(jī)化合物與濃硫酸在

3、催化劑作用下共熱消化，含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生氨,氨又與硫酸作用,變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨,氨用過量的硼酸溶液吸收,再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。1.2特點(diǎn)凱氏定氮法是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法，是測(cè)定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和最簡(jiǎn)單的方法之一，被國(guó)際國(guó)內(nèi)作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。凱氏定氮法樣品的最佳消化條件為硫酸銅2.50g,硫酸鉀0.10g,濃硫酸4.00mL；硫酸銅的用量為影響消化時(shí)間的主要因素,硫酸鉀和濃硫酸用量為第二和第三主要因素；用此最佳條件做實(shí)驗(yàn),消化時(shí)間僅為12min；與其他硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸用量方法對(duì)比,該法所需消

4、化時(shí)間最短,試劑用量減少,可降低實(shí)驗(yàn)成本,也降低了對(duì)環(huán)境的污染。凱氏定氮法適用范圍廣泛，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí),試劑消耗量大。若采用模塊式消化爐代替?zhèn)鹘y(tǒng)的消化裝置,可同時(shí)測(cè)定幾份樣品，節(jié)省時(shí)間,提高了工作效率，適用于批量蛋白質(zhì)的測(cè)定,具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。二、雙縮脲法(Biuret)2.1原理　　雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱,放出1個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物,稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵,或能夠以1個(gè)中間碳原子相連的肽鍵

5、,這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān),故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。2.2特點(diǎn)　　雙縮脲法中樣品的取用量對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性有顯著影響,采用0.5g樣品,40mL雙縮脲試劑的比例具有較高的檢測(cè)精度。雙縮脲法對(duì)不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近,不受溫度的影響?？煽焖贉y(cè)定蛋白質(zhì)含量，試劑單一,方法簡(jiǎn)便，但靈敏度差，測(cè)定范圍為1～20mg蛋白質(zhì)。適用于需要快速,但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定，常用于谷物蛋白質(zhì)含量測(cè)定。三、紫外吸收法3.1原理　　蛋白質(zhì)分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使

6、蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì),吸收峰在280nm處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質(zhì)含量成正比。此外,蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下,蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系,可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。3.2特點(diǎn)　　最常用的紫外吸收法是280nm的光吸收法，含有核酸的蛋白質(zhì)溶液使用280和260nm的吸收差法較好。蛋白質(zhì)的稀溶液采用215與225nm的吸收差法。紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定，測(cè)定后仍能回收使用。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè),因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化,而不需知道其

7、絕對(duì)值。　　缺點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差,干擾物質(zhì)較多,在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí),對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)有一定的誤差,故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì),會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸在紫外區(qū)也有強(qiáng)吸收，但通過校正可以消除。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的,雖然經(jīng)過校正,測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外,進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí),由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化,因此要注意溶液的pH值,測(cè)定樣品時(shí)的pH要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。四、考馬斯

8、亮藍(lán)法(Bradford)4.1原理　　Bradford法是根據(jù)蛋