蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較

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1、萬方數(shù)據(jù)蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較郭穎娜，孫衛(wèi)(華北制藥股份有限公司，河北石家莊050027)[摘要]蛋白質(zhì)與生命的起源、存在和進(jìn)化都密切相關(guān)，蛋白質(zhì)含量測(cè)定涉及到生產(chǎn)和科研的眾多領(lǐng)域。目前常用的．方法有凱氏定氮法、雙縮脲法(Biuret)、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)。本文總結(jié)各種方法的特點(diǎn)及適用條件，針對(duì)不同的待測(cè)樣品以及對(duì)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的要求不同，我們可以采用不同的方法來測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。．[關(guān)鍵詞]蛋白質(zhì)：凱氏定氮法；雙縮脲法；紫外吸收法；考馬斯亮藍(lán)法[中圖分類號(hào)】TS212．7[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A．[文章編號(hào)】1003—5095(2008)04—00

2、36-02蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法①iuret)、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)。其中Bradford法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。凱氏定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。這4種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：(1)實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；(2)蛋白質(zhì)的性質(zhì)；(3)溶液中存在的干擾物質(zhì)；(4)測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。1凱氏定氮法1．1原理

3、凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定4個(gè)過程。其原理是樣品中含氮有機(jī)化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化，含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生氨，氨又與硫酸作用，變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨，氨用過量的硼酸溶液吸收，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。1．2特點(diǎn)凱氏定氮法是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法，是測(cè)定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和最簡(jiǎn)單的方法之一，被國際國內(nèi)作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。凱氏定氮法樣品的最佳消化條件為硫酸銅2．50g，硫酸鉀0．10g，濃硫酸4．00mL；硫酸銅的用量為影響消化時(shí)間的主要因素，硫酸鉀和濃硫酸用量為第二和第三主要因素；用此最佳條件做實(shí)驗(yàn)

4、，消化時(shí)間僅為【收稿日期】2008-02-13[作者簡(jiǎn)介]郭穎娜(1979一)，女，助理工程師，從事質(zhì)檢工作。12min：與其他硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸用量方法對(duì)比，該法所需消化時(shí)間最短，試劑用量減少，可降低實(shí)驗(yàn)成本，也降低了對(duì)環(huán)境的污染。凱氏定氮法適用范圍廣泛，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，試劑消耗量大。若采用模塊式消化爐代替?zhèn)鹘y(tǒng)的消化裝置，可同時(shí)測(cè)定幾份樣品，節(jié)省時(shí)間，提高了工作效率，適用于批量蛋白質(zhì)的測(cè)定，具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。2雙縮脲法(Biuret)2．1原理雙縮脲(NHaCONHCONH3)是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出1個(gè)分子氨后

5、得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO。形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能夠以1個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。2．2特點(diǎn)雙縮脲法中樣品的取用量對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性有顯著影響，采用0．5g樣品，40ⅡlL雙縮脲試劑的比例具有較高的檢測(cè)精度。雙縮脲法對(duì)不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，不受溫度的影響。可快速測(cè)定蛋白質(zhì)含量，試劑單一，方法簡(jiǎn)便，但靈敏度差，測(cè)定范圍為1"--20mg蛋白質(zhì)。適用于需要快速，但并不需要十分精確的

6、蛋白質(zhì)測(cè)定，常用于谷物蛋白質(zhì)含量測(cè)定。．3紫外吸收法3．1原理蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性萬方數(shù)據(jù)第4期郭穎娜孫衛(wèi)：蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較-37．質(zhì)，吸收峰在280nm處，其吸光度(即光密度值)與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。3．2特點(diǎn)最常用的紫外吸收法是280n1]l的光吸收法，含有核酸的蛋白質(zhì)溶液使用280和260nm的吸收差法較好。蛋白質(zhì)的稀溶液采用215與225nm的吸收差，法。

7、紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定，測(cè)定后仍能回收使用。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。缺點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)較多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)有一定的誤差，故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸在紫外區(qū)也有強(qiáng)吸收，但通過校正可以消除。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸