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《mscs與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)復(fù)合ⅱ型膠原支架修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文MSCs與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)復(fù)合Ⅱ型膠原支架修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究姓名：李濤申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：外科學(xué)（骨外）指導(dǎo)教師：張偉20060508原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)仟由本人承擔(dān)。論文作者簽名：登日期：如6．上笞’關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解】
2、lJ東人學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許淪文被查閱和借閱；本人授權(quán)山東大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮E1J或其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。(保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定)?一：盟翩虢礬日期：型山東大學(xué)碩士學(xué)位論文MSCs與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)復(fù)合Ⅱ型膠原支架修復(fù)免關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究碩士研究生李濤導(dǎo)師張偉摘要目的關(guān)節(jié)軟骨損傷是骨科臨床的常見疾病。成熟關(guān)節(jié)軟骨的自身修復(fù)能力較差，除’J軟骨內(nèi)無
3、【fⅢ管、缺乏未分化的軟骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞被固定在一個致密的由膠原和蛋白多糖組成的固體基質(zhì)中有關(guān)外，可能還與以下兩個因素有關(guān)：①內(nèi)在修復(fù)依賴于軟骨細(xì)胞有絲分裂及短期內(nèi)增加的代謝產(chǎn)物(主要是膠原和蛋白多糖)，而成熟軟骨細(xì)胞有絲分裂能力極低：②外部愈合依賴于來自軟骨下骨的問充質(zhì)成分的參與，形成新的結(jié)締絹織，經(jīng)過一系列變化形成纖維軟骨。20世紀(jì)80年代以柬，組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為這一難題的解決提供了前所未有的機(jī)遇。人們利用軟’胃+組織工程技術(shù)，將細(xì)胞利支架材料復(fù)合培養(yǎng)，修復(fù)軟骨缺損已經(jīng)取得了初步成設(shè)。本課題
4、研究的目的是采用軟骨組織工程技術(shù)，體外分離骨髓刪充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)培養(yǎng)、傳代后與軟骨細(xì)胞以7：3混合再與II型膠原支架材料和PLGA復(fù)合培養(yǎng)，觀察細(xì)胞在兩種支架材料上黏附、伸展和增殖情況，并觀察其存動物實(shí)驗(yàn)中修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的情況。期望能夠找到軟骨組織’r程理想支架考才料與種子細(xì)胞。材料和方法l取3—4月齡健康新西蘭大白兔，穿刺抽取雙側(cè)脛骨上端骨髓6-8ml，Percoll分離法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)。2取3月齡新兩蘭白兔關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)關(guān)節(jié)軟骨，將軟骨片剪成O．3cmxo．3c
5、m大小，以O(shè)．2％的II型膠原酶消化810分鐘，離心、洗滌、汁數(shù)。將細(xì)胞接種于50ml培養(yǎng)瓶中，加入10％胎牛血清培養(yǎng)液5ml，在37％、5％C02、濕度飽山東大學(xué)碩士學(xué)位論文和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長接近融合后，以0．25％的胰酶消化收集備用。3．取經(jīng)過培養(yǎng)6天的MSCs和軟骨細(xì)胞以7：3的比例混合，調(diào)整細(xì)胞濃度為4x106／ml，與PLGA、II型膠原復(fù)合培養(yǎng)7天，進(jìn)行復(fù)合組織的病理形態(tài)學(xué)觀察；動物實(shí)驗(yàn)備用。觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在PLGA、II型膠原內(nèi)生長增殖情況．掃描電鏡觀察II型膠原支架材料以
6、及PLGA的結(jié)構(gòu)、孔隙率和細(xì)胞在支架內(nèi)的黏附和生長情況。4．取3-4月齡健康新西蘭大白兔30只，在實(shí)驗(yàn)兔的雙側(cè)股骨滑車處鉆直徑4mm，深度4-5mm的骨軟骨缺損，深達(dá)軟骨下區(qū)。隨機(jī)分為2組：A組，15只，右膝軟骨缺損處植入混合細(xì)胞復(fù)合Ⅱ型膠原材料；B組，15只，右膝軟骨缺損處植入混合細(xì)胞復(fù)合PLGA材料；C組，空白對照組，為上述兩組的左膝軟骨缺損處，不植入任何材料。分別于術(shù)后4、8、12周各處死5只動物，進(jìn)行大體和組織學(xué)觀察。結(jié)果1．細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代細(xì)胞接種后1．3閂可見少量細(xì)
7、胞貼壁，呈短梭形。3日后出現(xiàn)細(xì)胞集落，7-8日廣泛集落形成。12一14日細(xì)胞形成單層。傳代細(xì)胞貼壁快，7-8日形成單層，細(xì)胞核大，胞漿內(nèi)顆粒多。2．組織學(xué)觀察：細(xì)胞在II型膠原支架中分布、生長良好。細(xì)胞外基質(zhì)豐富，可見細(xì)胞外基質(zhì)片狀形成，甲苯胺藍(lán)染色顯示細(xì)胞周圍異染性基質(zhì)。PLGA孔隙率差，復(fù)合的細(xì)胞較少。II型膠原支架內(nèi)復(fù)合細(xì)胞的數(shù)量明顯高于PLGA支架。電鏡觀察：掃描電鏡顯示II型膠原纖維呈網(wǎng)架狀結(jié)構(gòu)，孔隙不規(guī)則，孔徑在100．20011m之間，孔壁厚度較均勻，為20一40IIm，孔隙率大于92％。
8、復(fù)合材料顯示細(xì)胞在lI型膠原支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以見到細(xì)胞分泌的基質(zhì)和細(xì)胞偽足的鉚固作用，表明支架材料具有良好的細(xì)胞親和性。PLGA孔隙規(guī)則，表面光滑，孔徑在200—30011m之間，孔壁厚度較均勻，為10．30pm，孔隙率約為82％，細(xì)胞黏附欠佳，水容性差，組織相容性不如lI型膠原纖原。3．動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果大體觀察：術(shù)后12周，A組缺損修復(fù)區(qū)組織與周圍關(guān)節(jié)軟骨相整合良好，軟骨缺損區(qū)被光滑白色半透明的組織覆蓋，與周圍軟骨組織外形無差
