補(bǔ)腎、柔肝中藥對軟骨細(xì)胞生物功能的影響

《補(bǔ)腎、柔肝中藥對軟骨細(xì)胞生物功能的影響》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、萬方數(shù)據(jù)·146·中國醫(yī)藥學(xué)報(bào)2004年第19卷增刊200403—．19JC—-20上海市中醫(yī)藥研究院骨傷科研究所石印玉馮偉曹月龍鄭昱新詹紅生徐宇徐超補(bǔ)腎、柔肝中藥對軟骨細(xì)胞生物功能的影響石印玉曹月龍馮偉鄭昱新石瑛王翔(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院骨傷研究所，上海200000)摘要：目的：比較補(bǔ)腎方和柔肝方對體外軟骨細(xì)胞生物學(xué)特征的影響。方法：用補(bǔ)腎方和柔肝方含藥血清培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，以MTr法檢測細(xì)胞增殖能力并確定相關(guān)血清藥理學(xué)的主要參數(shù)，綜合運(yùn)用組織細(xì)胞學(xué)、組織化學(xué)和分子生物學(xué)等方法觀察比較含藥血清對軟骨細(xì)胞生物學(xué)性能的影響。結(jié)果：補(bǔ)腎方和柔肝方均能促進(jìn)體外軟骨細(xì)胞的

2、增殖；促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)膠原和蛋白多糖的合成；對軟骨細(xì)胞分泌的PGE：無抑制作用。同時(shí)也不誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞異常分泌MMP一3。結(jié)論：補(bǔ)腎方和柔肝方對體外軟骨細(xì)胞生物學(xué)特征的影響具有相似的作用，即促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和基質(zhì)的合成。因此，為中醫(yī)藥以調(diào)攝肝腎為治療原則防治退行性骨關(guān)節(jié)炎提供了細(xì)胞學(xué)依據(jù)。關(guān)鍵詞：軟骨細(xì)胞；中醫(yī)藥；基質(zhì)；膠原；蛋白多糖；前列腺素E2(PGE2)；金屬蛋白酶(MMP-3)骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)樘卣鞯穆躁P(guān)節(jié)疾病，發(fā)病率隨年齡增長而增加。國外報(bào)道，60歲以上者，75％一80％可見OA的x線征象，20％有疼痛和活

3、動(dòng)受限。國內(nèi)調(diào)查結(jié)果OA發(fā)病率達(dá)2．2％一9％，其中北京郊區(qū)一項(xiàng)調(diào)查證實(shí)人群總患病率為9．56％，老年人群高達(dá)50％以上。體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)是研究關(guān)節(jié)軟骨的重要方法之一，因?yàn)楦淖兞塑浌羌?xì)胞的生存環(huán)境，必須通過控制相關(guān)實(shí)驗(yàn)參數(shù)來保持軟骨細(xì)胞的功能和表現(xiàn)型。國內(nèi)于1994年開始有血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。運(yùn)用此方法，可以直接觀察中藥的藥效學(xué)效應(yīng)，盡管血清藥理學(xué)還存在諸如血清采集時(shí)間、動(dòng)物給藥量與血清藥效的關(guān)系、含藥血清濃度與血清藥效的關(guān)系以及起效成分測定困難等問題，但它提供了一種研究中藥的新方法。基于以上背景。本項(xiàng)目在補(bǔ)腎方和柔肝方臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有效的基礎(chǔ)上，運(yùn)用

4、血清藥理和體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的方法，探討補(bǔ)腎、柔肝中藥對軟骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)與免疫組化觀察實(shí)驗(yàn)一細(xì)胞分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察1．材料與方法1．1主要試劑DMEM培養(yǎng)液、粗品膠原酶、胰蛋白酶、D．Hank’s平衡液、小牛血清。1．2主要儀器與材料培養(yǎng)箱(HeraeusB一5060EK—CO：)、超凈臺(上海凈化設(shè)備廠CSB—1)、倒置顯微鏡IOLYMPUS)、恒溫水浴鍋、恒溫磁力攪拌器、眼科手術(shù)器械，低溫離心機(jī)(typeMegafuge1．OR，Germany)、120目尼龍網(wǎng)篩過濾器、培養(yǎng)瓶(Unclon，丹麥)、計(jì)數(shù)器。1．3動(dòng)物4W齡健康新西

5、蘭種白兔。1．4軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)參用分階段酶消化法進(jìn)行【l’1引。2．結(jié)果倒置顯微鏡觀察和甲苯胺藍(lán)染色形態(tài)學(xué)觀察¨】．12j：分離、培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞呈圓球形，懸浮12h逐漸開始貼壁，24h大部分貼壁，5—7天細(xì)胞鋪滿，形成單層細(xì)胞層；此時(shí)細(xì)胞密集，細(xì)胞融合邊界不太清晰，胞核較大呈圓形或橢圓形，細(xì)胞有聚集成簇或叢狀，分泌基質(zhì)旺盛，分泌物堆積如菊花狀．此處的細(xì)胞和細(xì)胞核不清，甲苯胺藍(lán)異染為深紫藍(lán)色。第l一2代傳代細(xì)胞生長似原代細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)二軟骨細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色u卜b11．材料與方法1．1主要試劑Ⅱ型膠原單克隆抗體(FU-JI)、全組分SP免疫組化檢測試劑盒(華

6、美)、玻片(經(jīng)酸處理和高溫滅菌、大小已切割好)，PBS萬方數(shù)據(jù)2似年第19卷增刊中國醫(yī)藥學(xué)報(bào)平衡液(7．4)、95％酒精、濕盒。1．2方法參照免疫組化ABC法進(jìn)行。2．結(jié)果胞漿和細(xì)胞間隙有散在的棕色團(tuán)塊，為陽性染色，團(tuán)塊顏色不均勻，所培養(yǎng)的細(xì)胞是具有分泌特異性Ⅱ型膠原的軟骨細(xì)胞，可以用來實(shí)驗(yàn)。含藥血清對軟骨細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)研究及相關(guān)血清藥理學(xué)參數(shù)的確定實(shí)驗(yàn)一含藥兔血清制備¨6．17】1．材料與方法1．1器械18號和20號留置針、灌胃器、手術(shù)器械、試管、過濾器、0．451a,濾膜、注射器、麻醉藥品(乙醚：吸人；氯胺酮：肌注)、定時(shí)器、離心機(jī)。1．2藥品柔肝方由白芍、牡蠣

7、等養(yǎng)血柔肝藥組成，簡稱A；補(bǔ)腎方由熟地黃、仙靈脾等藥組成，簡稱T；補(bǔ)腎方[批號：981012]、柔肝方[批號：990614]為曙光醫(yī)院院內(nèi)制劑；維骨力(簡稱w，批號：03897)和扶他林(簡稱F，批號：99015)在醫(yī)院藥房購買。1．3方法將藥物按體表面積折算成動(dòng)物的等效劑量，再用生理鹽水配成8ml／d溶液灌胃，正常兔血清以生理鹽水8ml／d灌胃。連續(xù)兩次灌胃，中間間隔2h，分別在末次灌胃的1、3、5h采血，以確定短時(shí)間內(nèi)灌胃合適的給藥方案和采血時(shí)間點(diǎn)；然后與連續(xù)灌胃8d所采的血清進(jìn)行比較，以觀察1d短時(shí)間內(nèi)和8d長時(shí)間內(nèi)灌胃所取血清對軟骨細(xì)胞的影響，以確定長、