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《中藥補腎方對體外培養(yǎng)軟骨細胞影響論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、中藥補腎方對體外培養(yǎng)軟骨細胞影響論文趙瑜，馮齊鳳，朱祝生，劉日光【摘要】目的為了解中藥補腎方對體外培養(yǎng)軟骨細胞的作用。方法取ethodsThechondrocytesthecartilageofEM培養(yǎng)液(Gibco)、二甲基亞砜、MTT(美國Sigma)、TUNEL成套試劑盒(湖北省武漢博士德生物工程公司產品)。1.3鼠血清制備EM全培養(yǎng)基（含100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，10-8M地塞米松，VitC50μg/ml），將細胞團制成懸液，以200目篩網過篩，收集濾液，以6×106/ml密度接種，置37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，首次換液在3d后，其后每2d換液1次，至細胞長滿
2、培養(yǎng)瓶時傳代。1.5含藥血清的加入傳代細胞接種在24孔板中，接種密度2×104個/cm2,分對照組(正常血清)、補腎方實驗組(含藥血清分別為5%，10%，20%)。每組選6個培養(yǎng)孔，分別用相應的血清培養(yǎng)。1.6MTT增殖測定軟骨細胞培養(yǎng)5d后，每孔加MTT20μl(5mg/ml)溶于PBS中,濾過除菌,放入培養(yǎng)箱4h，取出，每孔加入50μl二甲基亞砜，振蕩混勻使結晶物充分溶解。在全自動酶標儀上檢測光密度(OD)值，檢測波長為492nm。1.7TUNEL法檢測軟骨細胞的凋亡按檢測試劑盒說明書操作。以胞漿出現棕色細小顆粒為陽性結果。陽性率計算：計數5個視野中的陽性細胞核(胞漿)數及總細胞核數，并
3、計算陽性細胞核數占細胞核總數的百分比。1.8數據處理采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行獨立樣本t檢驗，數據以±s表示。2結果不同濃度的補腎方含藥血清對培養(yǎng)軟骨細胞均顯示增殖刺激作用，與對照組比較P0.05。不同濃度的補腎方含藥血清對軟骨細胞凋亡率明顯低于對照組,差異存在顯著性P0.05。結果見表1。表1補腎方對家兔軟骨細胞增殖、凋亡率（略）3討論骨關節(jié)炎是一種臨床常見的老年人關節(jié)的退行性病變，它的發(fā)病率與年齡密切相關。Cooper等［1］研究表明，60歲后，100%的人膝關節(jié)軟骨將發(fā)生組織學退變；60%～70%的個體存在確定的膝OA證據。我國50歲以上的人群中骨關節(jié)炎的發(fā)病率約為50%，而6
4、5歲以上患有此病的女性和男性分別高達90%和80%。軟骨細胞是關節(jié)軟骨中唯一的細胞，它與由其分泌的細胞外基質共同組成具有獨特力學和生物學特性的物質，即軟骨。因此，軟骨細胞在軟骨形成、代謝以及修復中起著極其重要的作用。骨關節(jié)炎是以關節(jié)軟骨丟失以及軟骨細胞功能降低或喪失為主要特征的一類退行性關節(jié)疾病。但軟骨的修復是一個復雜的組織學變化過程，軟骨細胞在骨關節(jié)炎修復中起著十分重要的作用。如何促進軟骨細胞的增殖和延緩軟骨細胞凋亡，是需要研究的問題。中醫(yī)藥學在骨關節(jié)病的臨床治療中積累了豐富的經驗，為了進一步研究中醫(yī)藥延緩軟骨退變的作用機理，有必要建立軟骨細胞體外培養(yǎng)體系。而中藥復方多數是通過口服而起作用
5、的，用中藥粗制劑直接加入離體反應體系中進行實驗研究，在方法學上存在很多問題，如：中藥中的雜質成分、各種電解質或鞣質、以及不同酸堿度的影響等，都會對實驗結果造成一定的影響［2，3］。而用含藥血清進行體外實驗，可以排除以上各種因素的影響,比較接近藥物體內環(huán)境中產生藥理效應的過程。MTT光密度表達，反映了細胞增殖活性，反映一定時間的細胞增殖速度［4］。細胞凋亡的檢測方法主要包括形態(tài)學、生物化學、細胞學和分子生物學等改變。其中最重要和特征性的改變是Ca2+/Mg2+依賴性核酸內切酶的激活導致染色質DNA在核心小體連接部位斷裂，形成以180～200bp為最小單位的單體或寡聚體片段。因此，細胞凋亡過程中
6、DNA降解所產生的DNA片段大小具有獨特性質，常作為細胞凋亡特異性指標，其中TUNEL法則被廣泛應用的方法之一。本實驗結果表明，中藥補腎方含藥血清各濃度組的軟骨細胞增殖OD值明顯高于對照組(P0.05)，說明其能促進軟骨細胞的增生；而軟骨細胞凋亡率明顯低于對照組(P0.05)，說明其具有抑制軟骨細胞的異常凋亡的功效；說明中藥補腎方能通過抑制軟骨細胞異常凋亡，促進軟骨細胞增殖從而起到防治骨關節(jié)炎的作用。但本實驗結果是中藥補腎方含藥血清對體外培養(yǎng)成骨細胞的直接作用，其作用機理有待深入探討。【
