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1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文轉(zhuǎn)基因組織工程軟骨修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損Transgenictissueengineeredcartilageforrepairrabbitfull—thicknessarticularcartilagedefects專業(yè)：外科學(xué)學(xué)位申請人：盧華定指導(dǎo)老師：蔡道章教授論文答辯委員會主席：糊委員：，．籟鷹破中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院骨科廣州中國2005年5月中山大學(xué)博上論文中文摘要轉(zhuǎn)基因組織工程軟骨修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損專業(yè)外科學(xué)博士研究生盧華定導(dǎo)師蔡道章教授摘要一研究背景及目的由創(chuàng)傷、骨關(guān)節(jié)炎等引起的關(guān)節(jié)軟骨病損是骨科常見疾患，己成為導(dǎo)致中老年人殘疾的主
2、要原因。局限于軟骨淺層的欽損，依靠軟骨細胞有限的分裂能力僅有微小的內(nèi)源性修復(fù)或難以修復(fù)；全層關(guān)節(jié)軟骨缺損．由骨髓遷徙來的間充質(zhì)干細胞分化為軟骨細胞，形成的新生修復(fù)組織介于纖維軟骨和透明軟骨之間，其性能難與正常軟骨相比，逐漸出現(xiàn)退變。近年來探索應(yīng)用于臨床的許多方法，如鉆孔術(shù)、關(guān)節(jié)鏡下磨削及灌洗術(shù)、自體或異饞組織(骨膜、軟骨膜、骨軟骨塊等)移植、細胞(軟骨細胞或間充質(zhì)干細胞)移植等，雖在近期能獲得癥狀的改善，但未能使受損的軟骨在形態(tài)學(xué)、生化和生物力學(xué)方面恢復(fù)至正常，修復(fù)組織不能達到良好的遠期療效，常在短期內(nèi)發(fā)生退變。諸多嘗試說明在接受關(guān)節(jié)置換之前尚無公認(rèn)的有效手段。組織工程技
3、術(shù)可以通過獲取自體或異體少量組織細胞，在某些細胞因子的作用下，經(jīng)體外培養(yǎng)擴增后與支架材料復(fù)合，構(gòu)建與病損區(qū)形狀結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性相近的細胞一支架復(fù)合體，以修復(fù)或替代損傷組織。以自體軟骨細胞為種子細胞，存在來源有限，體外多次傳代培養(yǎng)易使細胞發(fā)生“去分化”，喪失分泌軟骨基質(zhì)的能力，因此難以用少量自體組織經(jīng)培養(yǎng)獲得大量有正常功能的軟骨細胞。干細胞如胚胎干細胞和骨髓基質(zhì)干細胞具有很強的分裂增殖能力及多向分化潛能，在一定條件下可以分化為軟骨細胞，但體外培養(yǎng)條件下如何誘導(dǎo)千細胞向軟骨細胞表型分化，以及如何維持軟骨細胞表型穩(wěn)定等目前尚未明確。同種異體軟骨細胞具有來源廣泛，可以一次性獲取大
4、量細胞等優(yōu)點．在三維立體中山大學(xué)博士論文中文摘要培養(yǎng)環(huán)境下可保持軟骨細胞分化特性，根據(jù)以往實驗證實異體軟骨細胞移植不發(fā)生嚴(yán)重免疫排斥反應(yīng)，顯示同種異體軟骨細胞可以作為軟骨組織工程的種子細胞。理想的支架對于成功構(gòu)建組織工程軟骨也至關(guān)重要。天然材料具有良好的細胞和組織相容性，但因初始機械力學(xué)強度不足現(xiàn)已較少使用，人工材料具有易加工、降解速率可調(diào)節(jié)、力學(xué)性能好、來源穩(wěn)定等優(yōu)點，但是一般人工合成的可降解材料具有較強疏水性的表面，而且其表面缺乏細胞可以識別的位點，因而普遍不具有良好的細胞相容性。將天然材料與人工材料以一定的方式結(jié)合起來，制成合成的多孔支架，以使兩者的優(yōu)點相結(jié)合，可望
5、制得較理想的軟骨組織工程支架。為成功構(gòu)建工程軟骨，需要促進軟骨細胞的增殖、維持細胞的表型、增進胞外基質(zhì)的合成，己證實有多種細胞因子如TGF．B、bFGF、IGF、HGF等能促進軟骨形成或刺激細胞增殖。近年來BMP7被發(fā)現(xiàn)能維持軟骨細胞的表型，誘導(dǎo)軟骨細胞外基質(zhì)如蛋白多糖和II型膠原的合成，并抑制由白介素一1(interleukin一1，lL．1)介導(dǎo)的軟骨基質(zhì)分解代謝。BMP7還能使體外培養(yǎng)中已經(jīng)表現(xiàn)反分化的軟骨細胞恢復(fù)表型，重新表達軟骨細胞特異性物質(zhì)。但外源性BMP7來源有限、半衰期短，易被創(chuàng)傷局部的蛋白酶所水解，且治療劑量相對較大，有可能導(dǎo)致毒性作用的產(chǎn)生限制了其應(yīng)用
6、。采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將BMP7因子的eDNA轉(zhuǎn)染軟骨細胞，可使之在體內(nèi)一定時間內(nèi)持續(xù)表達內(nèi)源性BMP7，以維持軟骨細胞的成軟骨生物學(xué)性狀。本實驗研究擬選用幼兔的關(guān)節(jié)軟骨細胞為種子細胞，在體外不同培養(yǎng)條件下觀察軟骨細胞的生物學(xué)性狀變化；通過構(gòu)建攜帶重組人BMP7eDNA的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)擴增的軟骨細胞；同時采用I型膠原和羥纂磷灰石復(fù)合，構(gòu)建柱狀分層的支架；將軟骨細胞種植其中培養(yǎng)，構(gòu)建小型組織工程軟骨復(fù)合體，觀察植入動物體內(nèi)修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的轉(zhuǎn)歸。二實驗方法與結(jié)果第一部分不同培養(yǎng)條件下軟骨細胞生物學(xué)性狀的變化方法：I型膠原支架通過以下步驟制作：將EDC按比例加入I型膠原
7、溶液中混合，倒入制作好的模具內(nèi)，4"C靜置24h．．80。C冷凍lh后脫模，再在冷凍干燥機中1I中山大學(xué)博士論文中文摘要處理12h，得到I型膠原支架。應(yīng)用序列酶消化法白2周齡新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中分離軟骨細胞，單層培養(yǎng)擴增。通過細胞生長曲線的測定，流式細胞儀檢測細胞DNA周期，透射電鏡檢測，以及II型膠原、S-100免疫組化染色檢測軟骨細胞在體外單層培養(yǎng)條件下的生物學(xué)性狀變化；將生長狀態(tài)良好的第2代細胞消化離·Ii,，接種于I型膠原支架三維立體培養(yǎng)3周，經(jīng)相差倒置顯微鏡、掃描電鏡、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測軟骨細胞在膠原支
