犬瘟熱病毒bei滅活苗的制備與免疫試驗(yàn)

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1、犬瘟熱病毒BEI滅活苗的制備與免疫試驗(yàn)范泉水葉俊華*夏咸柱#朱文靜*成都軍區(qū)聯(lián)勤部軍事醫(yī)學(xué)研究所，昆明650031(*公安部南昌警犬基地。南昌330100)(#解放軍農(nóng)牧大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春130062)摘要本文使用BEI滅活病毒的方法對(duì)LPCDV208強(qiáng)毒株進(jìn)行滅活，并加入蜂膠佐劑制備犬瘟熱病毒BEI滅活苗。將此滅活苗免疫接種CDV易感犬，同時(shí)以用福爾馬林滅活的犬瘟熱病毒滅活苗為對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果表明：犬瘟熱病毒BEI滅活苗安全、有效，其誘導(dǎo)試驗(yàn)犬所產(chǎn)生中和抗體的能力明顯高于該病毒的福爾馬林滅活苗。關(guān)鍵詞犬瘟熱病毒BEI滅活苗免疫烷化劑類滅活劑是一類含烷基分子

2、去一個(gè)氫原子(CnH2n+1)化合物，它能與另一種化合物作用，將烷基引入形成烷基取代物，根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為氮芥類、乙烯亞胺類和磺酸脂類。這類化合物的化學(xué)性質(zhì)活潑，其滅活機(jī)制主要在于烷化DNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤，引起單鏈斷裂、雙螺旋鍵交聯(lián)，妨礙RNA的合成，從而抑制細(xì)胞分裂。另外，也可與微生物的酶系統(tǒng)和核酸蛋白起作用，于擾核酸的代謝，因此，這類滅活劑能破壞病毒的核酸，使其完全喪失感染力。但并不損害其蛋白質(zhì)衣殼，得以保留其保護(hù)性抗原。故是制備滅活病毒病苗較好的滅活劑。據(jù)報(bào)道烷化荊類的乙烯亞胺有7種衍生物(AEI、BEI、CEI、EEI、CEEI、API及APO)，

3、其中滅活效果最好的是BEI和AEt(-二乙烯亞胺和乙?；蚁﹣啺?[1]。本研究采用BEI滅活病毒的方法對(duì)犬瘟熱病毒(Callilledistemper，CDV)強(qiáng)毒LPCDV208株進(jìn)行滅活。通過(guò)常規(guī)途徑研制出犬瘟熱病毒BEI滅活苗，經(jīng)安全性試驗(yàn)和免疫試驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果表明該滅活苗安全、可靠，其免疫原性明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的福爾馬林滅活苗?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：1材料和方法1．1病毒株犬瘟熱病毒強(qiáng)毒LPCDV20876株的第五代MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物，由本研究組分離獲得，人工感染犬試驗(yàn)表明：該強(qiáng)毒對(duì)犬免疫原性良好。1．2試驗(yàn)動(dòng)物2到3月齡CDV易感仔犬?dāng)?shù)65頭，選自肉犬市場(chǎng)。1．

4、3抗原的制備使用犬瘟熱病毒強(qiáng)毒LPCDV208株以10％的接毒量(體積比，以下同)單層接種于狗腎傳代細(xì)胞(MDCK)上，37。C培養(yǎng)96h后收獲病變細(xì)胞，連同上清一起凍融3次，作為試驗(yàn)用CDV細(xì)胞培養(yǎng)物，其毒力(TClDS0)為10—6／mL。一70℃保存。1．4滅活苗的制備1．4．1BEI滅活苗的制備取收獲的CDV細(xì)胞培養(yǎng)物凍融液，按100：1的比例加入2％BEI溶液在室溫條件下滅活28小時(shí)后，以50：1的比例加入2％硫代硫酸鈉中止，最后再按2：1的比例混合以蜂膠佐劑。制成BEI滅活苗，疫苗中的病毒臺(tái)量調(diào)整為1051℃Ⅲ50／mL。1．4．2對(duì)照滅活苗即犬瘟熱

5、病毒的福爾馬林滅活苗。取收獲的CDV細(xì)胞培養(yǎng)物凍融液，加l‰福爾馬林溶液滅活48小時(shí)，按2：1的比例加入蜂膠佐荊，制成福爾馬林滅活苗，疫苗中的病毒含量也調(diào)整為105TCm60／mL。1．6無(wú)菌檢驗(yàn)取少量的上述犬瘟熱病毒BEI滅插苗和福爾馬林滅活苗分別接種于普通瓊脂、血斜和肉湯培養(yǎng)基中，按常規(guī)方法檢測(cè)有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。1．7安全性試驗(yàn)選用CDVSN抗體小于1：2的易感仔犬15頭，每組5頭。第1組和第2組為試驗(yàn)組，每頭依次注射CDV的BEI滅活苗和福爾馬林滅活苗各10mL，口鼻滴人各5mL；第3組的5只犬不接種作正常對(duì)照。隔離飼養(yǎng)14天，每天作體溫、呼吸、精神、食欲、糞

6、便、尿性狀等臨床觀察。1．8免疫原性試驗(yàn)選取2到3月齡CDV易感仔犬65頭，分為7組，第1～3組為犬瘟熱病毒BE[滅活苗組，每組各10頭犬，分別肌肉注射犬瘟熱病毒BEI滅活苗4mL、2mL、lmL。第4—6組為犬瘟熱病毒福爾馬林滅活苗組。每組各10頭犬，分別肌肉注射犬瘟熱病毒福爾馬林滅活苗4mL、2mL、lull。第7組5頭犬不接種作為對(duì)照組。以組為單位隔離飼養(yǎng)，于接種后第14天采血作CDVSN抗體效價(jià)測(cè)定試驗(yàn)。第14天所有犬均肌肉注射CDV強(qiáng)毒LtVmV208原液4mL，隔離飼養(yǎng)，當(dāng)5頭對(duì)照犬全部呈現(xiàn)犬瘟熱病毒臨床癥狀與病理解剖學(xué)變化時(shí)，以能使lO頭試驗(yàn)犬中9

7、頭以上完全保護(hù)的CDV滅活苗最低接種量即為其最低免疫量。2結(jié)果2．1無(wú)菌檢驗(yàn)兩種犬瘟熱病毒滅活苗在三種培養(yǎng)基上的雜菌檢驗(yàn)均為陰性。2．2安全性試驗(yàn)注射兩種犬瘟熱病毒滅活苗后，均未引起易感犬發(fā)病與死亡，注射部位未見明顯的病理變化，免疫犬無(wú)任何不良反應(yīng)，精神、食欲良好。2．3免疫原性試驗(yàn)結(jié)果如表附表免疫原性與最低免疫劑量試驗(yàn)結(jié)果Table1Theresultsofimmunogenicityandmininalmimnmnedoseassay由上表可看出：接種2mL(2×105TCIDSO)以上的犬瘟熱病毒BEI滅活苗，即可使90％以上的CDV易感犬獲得免疫保護(hù)；而

8、使用犬瘟熱病毒福爾馬林滅