三七消減文庫構(gòu)建和皂甙合成關(guān)鍵酶基因克隆及表達

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1、陟歹lf大學博士學位論文題目三±逍遺窒廛掏建麴皇基金盛羞鍵酶基國杰隆盈塞選作者塑凰姜完成日期盟年衛(wèi)月～日培養(yǎng)單位：指導教師：專業(yè)：研究方向：授予學位El期：四刖太堂生金抖堂堂隨堂豎垂夔授遺籩堂坌王遺籩堂皇基國王猩生旦四，H大學博士學位論文三七消減文庫構(gòu)建和皂甙合成關(guān)鍵酶基因克隆及表達摘要三七(Panaxnotoginseng(Burk．)F．H．Chen)為五加科人參屬植物，是云南的道地藥材，有“南方人參”之稱，達瑪烷型四環(huán)三萜皂甙是三七的主要活性物質(zhì)，在血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、物質(zhì)代謝以及抗炎、抗衰老、抗腫

2、瘤等方面均布較好的活性。三七皂甙含量與三七的生長年限和生長部位有關(guān)。根部是重要藥用器官，且3年生根的皂甙含量高于1年生根。推測三七皂甙含量的時間性差異很可能和皂甙生物合成相關(guān)基因差異表達調(diào)控有關(guān)。為了解三七達瑪烷型皂甙合成的分子機理，必須首先克隆到相關(guān)的差異表達基因并進行深入的研究。該研究利用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建了三七1年生根和3年生根cDNA的正反向抑制減消文庫。結(jié)果表明：正向消減文庫包括2，000個cDNA克隆，反向消減文庫包括500個cDNA克隆，2個庫的重組率都在95％以上，cDN^片段的長度分布在200～900bp左右

3、，平均長度約500bp左右。消減效率檢測結(jié)果表明：消減雜交將18Sr對峨對照基因減弱了32，000倍。以上結(jié)果表明：所構(gòu)建的cDNA3℃庫能夠滿足下一步實驗的要求．對所得到的正反向消減文庫進行斑點雜交，分別從文庫中挑選插入片段在500bp左右的質(zhì)粒200個，與1年生和3年生DIG標記的SSH撩針分別進行雜交，篩選到110個來自只在三七3年生根中表達或表達量增加的基因，∞個來自只在三七1年生根中表達或表達量增加的基因。為進一步確定差異表達基因，我們從斑點雜交的陽性克隆中挑選了6個差異基因進行半定量RT--PCR驗證，結(jié)果表明：在3

4、年生根中發(fā)動蛋白鳥苷三磷酸酶效應子，T．谷氨酰水解酶，多銅氧化酶I型家族蛋白，IspG蛋白，還原型輔酶l氧化酶家族蛋白基因表達上調(diào)，而!腺苷高半胱氨酸水解酶基因表達下調(diào)，提示抑制消減雜交篩選到的大多基因如果在3年生根中高表達，則在1年生根中不表達或差異表達。6個差異表達xipq川大學博士學位論文基因同源比對功能分析結(jié)果表明：IspG蛋白是皂甙生物合成途徑中關(guān)鍵酶，其它5個基因可能與皂甙的合成有直接或間接關(guān)系。kpG蛋白生物信息學分析結(jié)果表明．TspG蛋白的EST由524個核苷酸組成，編碼146個氨基酸殘基，分子量為15．636K

5、I)a。有1個與轉(zhuǎn)錄子有關(guān)的結(jié)構(gòu)域，功能位點有N．豆蔻?；稽c，N．糖基化位點，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點。其同源性在植物中達90％以上，在微生物中達50％。亞細胞定位于細胞質(zhì)。對91個EST克隆測序和序列組裝分析結(jié)果表明：有4個重疊群(con69)和83個單拷貝EST(SingJe0，代表了共計87個獨立基N(Unigene)，其中23個cDNA含有polyA序列，占整個克隆數(shù)的26。4％。功能分類結(jié)果表明：已知功能的唯一序列共58個，占66．6％，未知功能唯一序列29個，占33．3％。對已知功能基因分類，得到11類，其中大多基因

6、與代謝途徑和分泌途徑有關(guān)。對37個氨基酸序列可通讀的EST進行生物信息學分析，其中跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽分析結(jié)果表明：3個克隆有跨膜結(jié)構(gòu)，8個克隆有信號肽或是信號錨定蛋白。功能位點分析結(jié)果表明：大多數(shù)基因與胞外分泌，調(diào)節(jié)細胞凋亡和細胞周期，信號傳導有關(guān)。功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明：除10個克隆沒有預測到功能結(jié)構(gòu)域外，其它結(jié)構(gòu)域與信號傳導，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，電子傳遞等有關(guān)。亞細胞定位大多數(shù)位于細胞質(zhì)中。鯊烯環(huán)氧酶是皂甙生物合成途徑過程中的1個重要的限速酶。根據(jù)人參鯊烯環(huán)氧酶c1)NA序列合成引物，我們從三七根中擴增到三七鯊烯環(huán)氧酶全長cDNA。該基

7、因開放閱讀框含有1，622個核苷酸，編碼537個氨基酸殘基，其分子量為59．139KDa，等電點為8．81(GenBank登錄號I)0386734)。同源性分析結(jié)果表明，三七鯊烯環(huán)氧酶與其它生物鯊烯環(huán)氧酶均具有不同程度的同源性。與人參鯊烯環(huán)氧酶同源性達到98％，進化樹的分析為同一祖先。生物信息學分析三七鯊烯環(huán)氧酶基因含有FAD功能區(qū)，以Rossmann折疊的NAD(P)一結(jié)合區(qū)，F(xiàn)AD／NAD(P)一結(jié)合區(qū)，疏水性，跨膜結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)和基序說明三七鯊烯環(huán)氧酶是一個膜蛋白，可從胞質(zhì)溶膠中分泌出來。三七鯊烯環(huán)氧酶中含有WDdomai

8、n，G-betarepeat保守結(jié)構(gòu)域，人參中卻沒有該結(jié)構(gòu)域。二者的亞細胞定位于質(zhì)體中．人參和三七的編碼基因中的密碼子偏愛性并不強，僅個別密碼予存在偏愛性。熒光定量PCR實驗結(jié)果證明，三七鯊烯環(huán)氧酶在三七不同組織中存在差異四川丈擎鼻士學位論文表達，在根中的表達水