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《western blot 原理和操作方法（全）》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、WesternBlot原理和操作方法（全）工作原理蛋白質(zhì)的電泳分離是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一,電泳是指帶電粒子在電場作用下,向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象.根據(jù)所采用的支持物不同,有瓊脂糖凝膠電泳,淀粉凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳等.其中,聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)由于無電滲作用,樣品用量少(1-100μg),分辨率高,可檢出10-9-10-12mol的樣品,凝膠機(jī)械強(qiáng)度大,重復(fù)性好以及可以通過調(diào)節(jié)單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的應(yīng)用.SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式,特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和
2、測定蛋白質(zhì)分子量.PAGE能有效的分離蛋白質(zhì),主要依據(jù)其分子量和電荷的差異,而SDS-PAGE(SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳)的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異,因?yàn)镾DS-PAGE的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中假如含有SDS和巰基乙醇(2-ME)或二巰基赤蘚醇(DTT),其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵,破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu),SDS是一種陰離子表面活性劑即去污劑,它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵,破壞蛋白質(zhì)分子的二級及三級結(jié)構(gòu),并與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合,破壞其折疊結(jié)構(gòu),電泳樣品假如樣品緩沖液后,要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合形
3、成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原劑巰基乙醇存在時(shí),蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被打開而不被氧化,蛋白質(zhì)也完全變性和解聚,并形成榛狀結(jié)構(gòu),穩(wěn)定的存在于均一的溶液中,SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷,平均每兩個(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS分子,這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其原來所帶的電荷,從而使蛋白質(zhì)原來所帶的電荷可以忽略不計(jì),消除了不同分子之間原有的電荷差別,其電泳遷移率主要取決于亞基分子質(zhì)量的大小,這樣分離出的譜帶也為蛋白質(zhì)的亞基.樣品處理液中通常加入溴酚藍(lán)染料,溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子,可以
4、自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí),即可停止電泳.另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加樣時(shí)樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部.重要參數(shù)①聚丙烯酰胺凝膠(PAG)制備原則:由于孔徑的大小取決于單體和雙體丙烯酰胺在凝膠中的總濃度(T)以及雙體占總濃度的百分含量即交聯(lián)度(C)決定的,因而制膠之前必須首先知道這兩個(gè)參數(shù).一般可以由下述公式計(jì)算:T%=(a+b)/m*100%;和C%=a/(a+b)*100%其中:a=雙體(bis)的重量;b=單體(arc)的重量;m=溶液的體積(ml)②當(dāng)分析一個(gè)未知樣品時(shí),常常
5、先用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)凝膠制成4-10的梯度凝膠進(jìn)行試驗(yàn),以便選擇理想的膠濃度.如果蛋白質(zhì)的分子量已知,可參考下表選擇所需凝膠濃度:蛋白質(zhì)分子量范圍(Da)適宜的凝膠濃度(%)<10420-301×104-4×10415-204×104-1×10510-151×105-5×1055-10>5×1052-5蛋白分子量(kDa)凝膠濃度(%)4-402012-451510-7012.515-1001025-2008③分離膠（5ml體積）:(ml)濃度6%8%10%12%15%DDH2O2.62.31.91.61.130%丙烯酰胺混合液1.01.31,72.02.51
6、.5mol/LTris(pH8.8)1.31.31,31.31.310%SDS0.050.050.050.050.0510%過硫酸銨（AP）0.050.050.050.050.05TEMED0.0040.0030.0020.0020.002(ml)體積（ml）12345DDH2O0.681.42.12.73.430%丙烯酰胺混合液0.170.330.50.670.831.0mol/LTris(pH6.8)0.130.250.380.50.6310%SDS0.010.020.030.040.0510%過硫酸銨（AP）0.010.020.030.040.05TE
7、MED0.0010.0020.0030.0040.0055%的積層膠的配置：蛋白質(zhì)的樣品制備：蛋白質(zhì)的樣品制備是WesternBlotting的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：1：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。4：防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑）5：樣
8、品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置
