western blot 原理與操作方法(全)

western blot 原理與操作方法(全)

ID:21835233

大小:58.50 KB

頁(yè)數(shù):10頁(yè)

時(shí)間:2018-10-25

western blot 原理與操作方法(全)_第1頁(yè)
western blot 原理與操作方法(全)_第2頁(yè)
western blot 原理與操作方法(全)_第3頁(yè)
western blot 原理與操作方法(全)_第4頁(yè)
western blot 原理與操作方法(全)_第5頁(yè)
資源描述:

《western blot 原理與操作方法(全)》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。

1、No.1WesternBlot原理和操作方法(全)WesternBlot工作原理蛋白質(zhì)的電泳分離是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一,電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下,向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象.根據(jù)所采用的支持物不同,有瓊脂糖凝膠電泳,淀粉凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳等.其中,聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)由于無(wú)電滲作用,樣品用量少(1-100μg),分辨率高,可檢出10-9-10-12mol的樣品,凝膠機(jī)械強(qiáng)度大,重復(fù)性好以及可以通過(guò)調(diào)節(jié)單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的應(yīng)用.SDS-PAGE是最常用

2、的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式,特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量.PAGE能有效的分離蛋白質(zhì),主要依據(jù)其分子量和電荷的差異,而SDS-PAGE(SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳)的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異,因?yàn)镾DS-PAGE的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中加入含有SDS和巰基乙醇(2-ME)或二巰基赤蘚醇(DTT),其可以斷開(kāi)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵,破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu),SDS是一種陰離子表面活性劑即去污劑,它可以斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵,破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu),并與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合,破壞其折疊結(jié)

3、構(gòu),電泳樣品加入樣品緩沖液后,要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原劑巰基乙醇存在時(shí),蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被打開(kāi)而不被氧化,蛋白質(zhì)也完全變性和解聚,并形成榛狀結(jié)構(gòu),穩(wěn)定的存在于均一的溶液中,SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷,平均每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS分子,這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其原來(lái)所帶的電荷,從而使蛋白質(zhì)原來(lái)所帶的電荷可以忽略不計(jì),消除了不同分子之間原有的電荷差別,其電泳遷移率主要取決于亞基分子質(zhì)量的大小

4、,這樣分離出的譜帶也為蛋白質(zhì)的亞基.樣品處理液中通常加入溴酚藍(lán)染料,溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子,可以自由通過(guò)凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí),即可停止電泳.另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加樣時(shí)樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部.重要參數(shù)①聚丙烯酰胺凝膠(PAG)制備原則:由于孔徑的大小取決于單體和雙體丙烯酰胺在凝膠中的總濃度(T)以及雙體占總濃度的百分含量即交聯(lián)度(C)決定的,因而制膠之前必須首先知道這兩個(gè)參數(shù).一般可以由下述公式計(jì)算:T%=(a+b)/m*100%;和C%=a/(

5、a+b)*100%其中:a=雙體(bis)的重量;b=單體(arc)的重量;m=溶液的體積(ml)②當(dāng)分析一個(gè)未知樣品時(shí),常常先用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)凝膠制成4-10的梯度凝膠進(jìn)行試驗(yàn),以便選擇理想的膠濃度.如果蛋白質(zhì)的分子量已知,可參考下表選擇所需凝膠濃度:蛋白質(zhì)分子量范圍(Da)適宜的凝膠濃度(%)<10420-301×104-4×10415-204×104-1×10510-151×105-5×1055-10>5×1052-5③分離膠:電泳凝膠濃度試劑10%12%15%10%12%15%H2O(ml)4.03.32.35.94.93.4

6、30%丙烯酰胺(T:30%,C:3%(ml)3.34.05.05.06.07.51.5mol/lTris.cl(PH8.8)(ml)2.52.52.53.83.83.810%SDS(ml)0.10.10.10.150.150.1510%AP(ml)0.10.10.10.150.150.15TEMED(μl)444666總體積(ml)1015④濃縮膠試劑濃度(5%)H2O(ml)4230%丙烯酰胺(T:30%,C:3%(ml)10.51.0mol/lTris.cl(PH8.8)(ml)10.510%SDS(μl)804010%AP(μl

7、)6030TEMED(μl)84總體積(ml)63蛋白質(zhì)的樣品制備:蛋白質(zhì)的樣品制備是WesternBlotting的第一步,樣品制備是關(guān)鍵步驟,要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì),應(yīng)注意以下問(wèn)題:1:在合適的鹽濃度下,應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。2:選擇合適的表面活性劑和還原劑,破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵,使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。3:盡量去除核酸,多糖,脂類(lèi)等干擾分子。4:防止蛋白質(zhì)在樣品處理過(guò)程中的人為的修飾,制備過(guò)程應(yīng)在低溫下進(jìn)行,以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類(lèi)的修飾(建議加入合適的蛋白酶抑制劑)5:樣品

8、建議分裝成合適的量,然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80℃中保存,但要注意不要反復(fù)凍融。一:準(zhǔn)備工作:一個(gè)水浴箱,一臺(tái)超聲裝置,組織勻漿器二:需要的溶液:裂解液Laemmli樣品緩沖液三:操作步驟:1)培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品

當(dāng)前文檔最多預(yù)覽五頁(yè),下載文檔查看全文

此文檔下載收益歸作者所有

當(dāng)前文檔最多預(yù)覽五頁(yè),下載文檔查看全文
溫馨提示:
1. 部分包含數(shù)學(xué)公式或PPT動(dòng)畫(huà)的文件,查看預(yù)覽時(shí)可能會(huì)顯示錯(cuò)亂或異常,文件下載后無(wú)此問(wèn)題,請(qǐng)放心下載。
2. 本文檔由用戶(hù)上傳,版權(quán)歸屬用戶(hù),天天文庫(kù)負(fù)責(zé)整理代發(fā)布。如果您對(duì)本文檔版權(quán)有爭(zhēng)議請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系客服。
3. 下載前請(qǐng)仔細(xì)閱讀文檔內(nèi)容,確認(rèn)文檔內(nèi)容符合您的需求后進(jìn)行下載,若出現(xiàn)內(nèi)容與標(biāo)題不符可向本站投訴處理。
4. 下載文檔時(shí)可能由于網(wǎng)絡(luò)波動(dòng)等原因無(wú)法下載或下載錯(cuò)誤,付費(fèi)完成后未能成功下載的用戶(hù)請(qǐng)聯(lián)系客服處理。