高效液相色譜 課件

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1、HighPerformanceLiquidChromatography（HPLC）高效液相色譜技術(shù)與應(yīng)用主要內(nèi)容酸性和堿性樣品酸堿平衡與反相保留緩沖液的選擇pKa與化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系離子樣品反相分離的優(yōu)化選擇性的控制離子對(duì)色譜保留機(jī)制初始實(shí)驗(yàn)控制保留值范圍和選擇性離子交換色譜離子交換色譜保留機(jī)制方法建立硅膠柱酸性樣品和堿性樣品為方便討論，我們定義“離子溶質(zhì)”為在通常pH范圍內(nèi)含有一個(gè)或一個(gè)以上酸性或堿性官能團(tuán)的有機(jī)分子。在HPLC分離條件下，離子電荷隨pH發(fā)生變化的化合物簡(jiǎn)單地稱作酸或堿。在反相色譜（RPC）中，　疏水化合物樣品的保留值較大。當(dāng)某種酸（HA）或堿（B）發(fā)生解離，其疏水性將會(huì)大

2、大減弱。因此在RPC中的保留值k可能下降10~20倍。幾乎所有與pH相關(guān)的保留值變化均發(fā)生于pKa值±1.5單位的pH值范圍內(nèi)緩沖液的選擇最好先調(diào)節(jié)緩沖劑的pH，再加入有機(jī)溶劑。選擇具體緩沖劑時(shí)，應(yīng)切記的幾種因素：緩沖容量UV吸收度其它性質(zhì)：溶解度、穩(wěn)定性、與樣品和/或色譜柱的相互作用、揮發(fā)性、對(duì)HPLC系統(tǒng)的腐蝕等緩沖容量緩沖容量由pH、緩沖劑pKa及其濃度決定與樣品化合物的情況類似，緩沖劑發(fā)生解離的pH范圍為pKa±1.5。只有在此pH范圍內(nèi)緩沖劑才能有效地控制pH值。10~50mM濃度的緩沖劑對(duì)RPC分離一般足夠pKa與化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系若不知樣品組分的pKa值，可以通過(guò)樣品的分子結(jié)構(gòu)

3、估計(jì)出。較好的流動(dòng)相pH樣品中最常見(jiàn)的酸或堿取代基[-NH2、-N(CH3)2等]、堿性雜環(huán)和羧酸（-COOH）基團(tuán)。與pH有關(guān)的保留值變化最可能發(fā)生于pH3~6的范圍內(nèi)，不包括烷基胺化合物。無(wú)論已知還是未知樣品，開(kāi)始RPC方法建立時(shí)最好選用pH微小改變不影響分離的流動(dòng)相（pH<3）哪種HPLC法對(duì)離子樣品最合適RPC具有簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣和較好的柱性能等特點(diǎn)，通常是首先的分離模式。若分離不夠理想，還可考慮在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑。在離子對(duì)試劑濃度由零變至最大值時(shí)，會(huì)有RPC－IPC保留值的連續(xù)變化。所以起初的RPC實(shí)驗(yàn)有助于后面IPC分離條件的優(yōu)化選擇。對(duì)特殊分離目的，可以考慮從離子對(duì)或離

4、子交換色譜開(kāi)始。優(yōu)化離子樣品的相分離離子樣品反相分離的方法建立與中性樣品有些相似，主要差異為需用：經(jīng)pH緩沖的流動(dòng)相硅羥基效應(yīng)最小的反相柱當(dāng)首次開(kāi)始HPLC方法建立時(shí)，并不知道合適的分離是否需要改變pH，所以初始實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相pH＜3最好。下一步通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相強(qiáng)度（%B），以使樣品具有合適的保留值范圍0.5

5、柱壓選擇性的控制改變pH是改變分離選擇性的最有效方式pH值變化常?？蓪?dǎo)致離子化合物k值發(fā)生10倍或更大的變化。其它可有效改變峰間距的條件是%B、溶劑類型（甲醇、乙腈、THF）、溫度、柱類型（C8、C18、苯基、氰基）與緩沖劑濃度。離子對(duì)色譜離子對(duì)和反相HPLC共享有多種特征兩種分離使用的色譜柱和流動(dòng)相大致相似，主要區(qū)別是離子對(duì)色譜（IPC）的流動(dòng)相中加入了離子對(duì)試劑。邏輯上，IPC是需進(jìn)一步改善的RPC分離的一種補(bǔ)充方法保留的基礎(chǔ)離子對(duì)試劑的濃度通過(guò)改變被固定相吸收的離子對(duì)試劑的多少，有可能將保留過(guò)程由反相連續(xù)地改變?yōu)殡x子交換色譜當(dāng)色譜柱吸收的離子對(duì)試劑量增大，離子交換保留機(jī)制為主，而反相

6、保留機(jī)制為次要初始實(shí)驗(yàn)特殊離子對(duì)試劑的選擇(強(qiáng)疏水性或弱疏水性)依賴于流動(dòng)相強(qiáng)度%B特殊問(wèn)題人工峰盡可能相近地匹配樣品溶劑和流動(dòng)相的組成，增大進(jìn)樣濃度、減小進(jìn)樣體積緩慢的色譜柱平衡陰離子試劑（如磺酸鹽）用50-80%的甲醇－水作清洗劑易于除去。季銨試劑需用50%的甲醇－緩沖劑進(jìn)行清洗。在用新流動(dòng)相檢查保留值重現(xiàn)性之前，應(yīng)至少用20倍體積的清洗溶劑進(jìn)行清洗。較差的峰形硅羥基溫度離子交換色譜離子交換色譜（IEC）可用于包括生物來(lái)源的混合物（氨基酸、低聚核苷酸、肽、蛋白質(zhì)、核酸）、無(wú)機(jī)鹽和一些金屬有機(jī)化合物因?yàn)镮EC與離子對(duì)HPLC保留機(jī)制的相似性，許多可用IEC的分離也用IPC也可解決。用IE

7、C原因：檢測(cè)限制備分離多步分離保留的基礎(chǔ)對(duì)于帶電荷z的樣品離子和一價(jià)的反離子，反離子濃度對(duì)其保留值的影響可總結(jié)為：與固定相共價(jià)相連的荷電基團(tuán)決定用于離子交換的色譜柱的特性：陰離子交換柱帶正電荷，陽(yáng)離子柱帶負(fù)電荷。陽(yáng)離子柱用于陽(yáng)離子的分離，如質(zhì)子化堿；陰離子柱用于陰離子的或酸性樣品的分離固定相用R－（陽(yáng)離子交換劑）或R＋（陰離子交換劑）表示，樣品用X＋（陽(yáng)離子）或X－（陰離子）表示，IEC的保留過(guò)程：pH影響IEC一般用于