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1、測(cè)定蛋白含量測(cè)定粗蛋白測(cè)定（凱氏定氮法）：水溶性蛋白測(cè)定：種子干燥后，研磨過60目篩，稱取種子粉3.0000g，于瓷研缽中，加少量水研磨至勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，放入50℃恒溫振蕩水浴中振蕩提取30min，以4000r／min離心取上清液，用蒸餾水再洗殘?jiān)?次，重復(fù)以上過程，合并上清液（定溶到50mL），作為水溶性蛋白測(cè)定樣品。球蛋白測(cè)定：在沉淀中再添加10%（W/V）氯化鈉，重復(fù)提取3次，上清液（定溶到50mL）即為球蛋白樣品。醇溶蛋白測(cè)定：在沉淀中再添加75%乙醇，重復(fù)提取3次，上清液（定溶到50mL）即為醇溶蛋白樣品。堿溶蛋白（谷蛋白）測(cè)定：在沉淀中再添加0
2、.2%（W/V）氫氧化鈉，重復(fù)提取3次，上清液（定溶到50mL）即為堿溶蛋白（谷蛋白）樣品。最后，上述B、C、D、E樣品采用同A的方法進(jìn)行測(cè)定。微量凱氏定氮法原理：生物材料的含氮量測(cè)定在生物化學(xué)研究中具有一定的意義，如蛋白質(zhì)的含氮量約為16％，測(cè)出含氮量則可推知蛋白含量。生物材料總氮量的測(cè)定，通常采用微量凱氏定氮法。凱氏定氮法由于具有測(cè)定準(zhǔn)確度高，可測(cè)定各種不同形態(tài)樣品等兩大優(yōu)點(diǎn)，因而被公認(rèn)為是測(cè)定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。其原理如下：1.消化：有機(jī)物與濃硫酸供熱，使有機(jī)氮全部轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮——硫酸銨。為加快反應(yīng)，添加硫酸銅和硫
3、酸鉀的混合物；前者為催化劑，后者可提高硫酸沸點(diǎn)。這一步約需30min至1h，視樣品的性質(zhì)而定。2.加堿蒸餾：硫酸銨與NaOH(濃)作用生成(NH4)OH,加熱后生成NH3,通過蒸餾導(dǎo)入過量酸中和生成NH4Cl而被吸收。3.滴定：用過量標(biāo)準(zhǔn)HCl吸收NH3，剩余的酸可用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，由所用HCl摩爾數(shù)減去滴定耗去的NaOH摩爾數(shù)，即為被吸收的NH3摩爾數(shù)。此法為回滴法，采用甲基紅衛(wèi)指示劑。HCl＋NaOHNaCl+H2O本法適用于0.2~2.0mg的氮量測(cè)定。1.熱源2.燒瓶3.玻璃管4.橡皮管5．玻璃杯6.棒狀玻塞7.反應(yīng)室8.反應(yīng)室外殼9.夾子10.反應(yīng)
4、室中插管11.冷凝管12.錐形瓶13.石棉網(wǎng)圖3.4微量凱氏蒸餾裝置示意圖一、試劑濃硫酸；30％過氧化氫溶液；40%氫氧化鈉；0.01M的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸；標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨（0.3mg氮/mL）。催化劑：硫酸鉀—硫酸銅混合物：硫酸鉀與硫酸銅（CuSO4、5H2O）以3：1（W/W）的配比混合研磨成粉末。指示劑：方法一：取50毫升0.1%甲烯藍(lán)無水醇溶液與200毫升0.1%甲基紅無水乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶備用，這種指示劑酸性時(shí)為紫色，堿性時(shí)為綠色，變色范圍窄且靈敏。方法二：0.1%溴甲酚綠乙醇溶液10毫升與0.1%甲基紅乙醇溶液2毫升混和即成。本指示劑的變色范圍為紫紅色
5、灰色綠色標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液（0.3毫克氮/毫升）；硼酸一指示劑混合液：取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示劑貯備液，搖勻后溶液呈現(xiàn)紫紅色即可。（約加1毫升左右混合指示劑）5%三氯乙酸二、測(cè)試樣品：上述A：取0.3000g，B/C/D/E樣品，按要求處理后，取5mL溶液進(jìn)行消化。三、器材微量凱氏定氮儀；移液管1mL（×3）；2mL（×1）；微量滴定管5mL（×1）;燒杯200mL（×2）；量筒10mL（×1）；三角燒瓶150mL（×4）；凱氏燒瓶50mL（×4），吸耳球（×1）；電爐；分析天平。操作方法一、樣品處理準(zhǔn)確稱取烘至恒重的樣品0.3000g，置10mL離
6、心管中，加入5mL5%三氯乙酸，在90℃水浴中浸提15分鐘，不時(shí)攪拌，取出后用少量蒸餾水沖洗玻棒，待溶液冷卻后，4000r/min離心15分鐘。并用5mL5%三氯乙酸洗沉淀2-3次，離心，棄去上清液，最后用蒸餾水將沉淀無損地洗入鋪有濾紙的漏斗上，去掉濾液，將沉淀和濾紙?jiān)?0℃下烘干，用于蛋白氮的測(cè)定。二、消化取4只凱氏燒瓶，并編號(hào)，1號(hào)直接放入稱好的樣品0.3000g，用于測(cè)定總氮。2號(hào)放入上述烘干的濾紙和沉淀，用于蛋白氮的測(cè)定，3號(hào)放入同樣濾紙一張，4號(hào)管不加任何樣品作為空白對(duì)照，注意要將樣品放入到底部。分別在每個(gè)凱氏燒瓶中加入約0.3-0.5g硫酸鉀－硫酸
7、銅混合物，再加5mL濃硫酸。將樣品浸泡數(shù)小時(shí)或放置過夜后，在管口蓋一小漏斗，放在通風(fēng)櫥中電爐上加熱。在消化開始時(shí)應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化,使瓶內(nèi)液體微微沸騰，大約維持2~3h。待消化液變成褐色后，為了加速完成消化，可將燒瓶取下，稍冷，將30％過氧化氫溶液1~2滴加到燒瓶底部消化液中，再繼續(xù)消化，直到消化液由淡黃色變成透明淡藍(lán)綠色，消化即告完成。冷卻后將瓶中的消化液倒入100mL容量瓶中，并以蒸餾水洗滌燒瓶數(shù)次，將洗液并入容量瓶中，定容備用。若在消化中發(fā)現(xiàn)瓶壁上有黑色顆粒時(shí)，應(yīng)小心地轉(zhuǎn)
8、動(dòng)消化管，用消化液將它沖洗下來，以保證
