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1、色譜分析 在藥物分析中的運(yùn)用2005年1月1一、概述色譜學(xué)已發(fā)展成為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科醫(yī)藥領(lǐng)域是色譜應(yīng)用的重要領(lǐng)域之一液相色譜目前在常規(guī)分析儀器中的排列2色譜學(xué)已發(fā)展成為 一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科色譜作為分離分析學(xué)科，已有近一個(gè)世紀(jì)的發(fā)展過(guò)程。進(jìn)入20世紀(jì)以來(lái)，科學(xué)技術(shù)有了飛速發(fā)展，色譜學(xué)已發(fā)展成為一個(gè)獨(dú)立學(xué)科，形成了薄層色譜、氣相色譜、液相色譜、離子色譜、超臨界流體色譜、親合色譜、疏水色譜、毛細(xì)管電泳和電色譜等許多分支。各種色譜儀與質(zhì)譜，紅外核磁等技術(shù)聯(lián)用儀器已成為令人矚目的高新技術(shù)產(chǎn)品。3醫(yī)藥領(lǐng)域是色譜應(yīng)用的 重要領(lǐng)域之一在藥物分析中，利用色譜分析方法顯得更為重要，尤其是高效液
2、相色譜法（HPLC）是目前藥物分析中最常用的分析手段。它主要用于復(fù)雜成分、混合物的分離，即可用來(lái)作藥物的定性、定量及雜質(zhì)檢查。由于高效液相色譜法分析樣品的范圍不受沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性、相對(duì)分子質(zhì)量大小及有機(jī)物與無(wú)機(jī)物的限制，使其應(yīng)用范圍極廣。一般說(shuō)來(lái)，只要能將樣品制成溶液，就可分析。且分離速度快，靈敏度高，色譜柱可反復(fù)使用，可選擇的流動(dòng)相比氣相色譜法多。流出組分不被破壞，且容易收集，可在室溫下操作，絕大部分藥物均可用高效液相色譜法來(lái)作。4液相色譜目前在常規(guī)分析 儀器中的排列在2000年版一、二部藥典中，用高效液相色譜法測(cè)定的品種比1995年版藥典成倍地增加，2005年版一、
3、二部藥典又增加幾倍。而高效液相色譜法在幾種儀器分析方法中，其分析數(shù)量的排列為第二，因其分離效率高，又能準(zhǔn)確地反映所測(cè)成分的真實(shí)含量。中國(guó)藥典應(yīng)用高效液相色譜法的情況，目前僅次于美國(guó)藥典，而優(yōu)于英國(guó)藥典和日本藥局方。5二、共同探討高效液相色譜 在實(shí)際操作中的部分問(wèn)題高效液相色譜方法的建立色譜分離類型的選擇溶劑的選擇溶劑純化溶劑的脫氣樣品溶劑的選擇檢測(cè)器的選擇系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)無(wú)參比標(biāo)準(zhǔn)的純度評(píng)價(jià)HPLC在藥物分析中的應(yīng)用范圍6高效液相色譜方法的建立應(yīng)用HPLC對(duì)樣品進(jìn)行分離、分析，主要根據(jù)樣品的性質(zhì)，選擇合適的分離類型及所用的色譜柱和流動(dòng)相、檢測(cè)器等。（一）樣品的性質(zhì)樣品中
4、待測(cè)組分的分子量大小、化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶解性等化學(xué)、物理性質(zhì)決定著色譜分離類型的選擇。7色譜分離類型的選擇高效液相色譜的各種方法有其各自的特點(diǎn)和應(yīng)用范圍，應(yīng)根據(jù)分離分析的目的，樣品的性質(zhì)和含量、現(xiàn)有的設(shè)備條件等選擇合適的方法。通常分離類型應(yīng)根據(jù)樣品的性質(zhì)（如相對(duì)分子質(zhì)量的大小，化學(xué)結(jié)構(gòu)，溶解性及極性等）來(lái)選擇，并根據(jù)此條件選擇色譜柱和流動(dòng)相。8溶劑的選擇在高效液相色譜分析中，流動(dòng)相的種類、配比，對(duì)色譜分離效果影響很大，可供選擇的固定相填料種類較少。因此，流動(dòng)相的選擇顯得自關(guān)重要。（1）溶劑純度要高（2）不能引起柱效損失或保留特性變化（3）常用固定相與流動(dòng)相的選擇（4）溶劑系
5、統(tǒng)的選擇常用（5）緩沖系統(tǒng)及緩沖溶液的處理9溶劑純化在HPLC分離測(cè)定中，溶劑的純度是很關(guān)鍵的。溶劑足夠純才不至于產(chǎn)生問(wèn)題，對(duì)溶劑純度的要求依應(yīng)用情況而定。10溶劑的脫氣液相色譜儀的檢測(cè)器常被溶劑中的氣泡干擾，氣泡的形成是由于被空氣飽和的溶劑從高壓流向低壓，如柱出口，這些氣泡形成干擾檢測(cè)器光學(xué)道路的折射表面。因此，限制氣泡和伴隨的噪音的常用辦法是在用前從溶劑中除去氣泡。常用的脫氣方法有真空泵脫氣法和煮沸脫氣法。1．真空泵脫氣2．煮沸脫氣法3．溶劑的濾過(guò)11樣品溶劑的選擇樣品的溶劑應(yīng)對(duì)樣品溶解性大，且對(duì)樣品穩(wěn)定并與檢測(cè)器相匹配，最好與流動(dòng)相相同，這樣可允許大量的進(jìn)樣量，
6、但待測(cè)物的洗脫不應(yīng)受影響，當(dāng)樣品溶劑與流動(dòng)相不同時(shí)，則會(huì)出現(xiàn)樣品溶劑的峰。1213緩沖溶劑的注意事項(xiàng)色譜柱使用的流動(dòng)相pH值范圍為2.5～7.5為宜。酸性太強(qiáng)會(huì)使鍵合的烷基脫落，堿性太強(qiáng)會(huì)使硅膠溶解，通常用緩沖液維持一定的pH值。緩沖液濃度范圍為0.005～0.5mol/L，盡量用稀溶液為好，在用水和有機(jī)溶劑系統(tǒng)中，應(yīng)注意鹽的存在會(huì)改變?nèi)軇┑目苫旌闲?，在色譜分離過(guò)程中，絕不能發(fā)生相的分離和鹽的沉淀。在HPLC中，最常用的緩沖溶液是醋酸鹽和磷酸鹽緩沖液。14檢測(cè)器的選擇HPLC檢測(cè)中，當(dāng)樣品有紫外吸收時(shí)，常選用紫外檢測(cè)器，在藥物分析文獻(xiàn)中，用紫外檢測(cè)器的占95%以上，使
7、用時(shí)要注意溶劑的使用波長(zhǎng)，即溶劑的極限波長(zhǎng)必須低于檢測(cè)波長(zhǎng)。若使用熒光檢測(cè)器或電化學(xué)檢測(cè)器，可使靈敏度提高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，但不是所有化合物都有熒光，無(wú)熒光的物質(zhì)可經(jīng)衍生化作用形成熒光的化合物。電化學(xué)檢測(cè)適用于有氧化還原性的藥物。15系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)當(dāng)選用HPLC方法后，不同操作者各實(shí)驗(yàn)室之間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性應(yīng)引起注意。在HPLC中，很難實(shí)現(xiàn)很好的重現(xiàn)性，因有許多具有相同名稱的填料，由于生產(chǎn)廠家不同，性質(zhì)也不盡相同。有許多HPLC填料或柱隨著使用而變壞，其原因是填料的水解或柱死體積因填料溶解而增加，因此面臨著色譜柱是否與建立方法時(shí)的柱效相同的問(wèn)題。當(dāng)用H
