t載體克隆的dna序列分析

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1、T載體克隆的DNA序列分析實驗?zāi)康模毫私獬Ｒ?guī)DNA序列分析技術(shù)（Sanger雙脫氧法）的原理及操作步驟。實驗原理：在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前用于測序的技術(shù)主要有Sanger等（1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和Gilbert（1977）發(fā)明的化學降解法。兩種方法在原理上差異很大，但都是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，產(chǎn)生A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。目前Sanger測

2、序法得到了廣泛的應(yīng)用。Sanger法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的

3、的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。圖9-1Sanger雙脫氧法DNA測序原理自動化測序?qū)嶋H上已成為當今DNA序列分析的主流。美國PEABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測序儀，其中310型是社會上提供DNA測序服務(wù)的生物技術(shù)公司中使用最多的一種型號。本實驗介紹的是ABIPRISM310型DNA測序儀的測序原理和操作規(guī)程。310型基因分析儀（即DNA測序儀），采用毛細管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用

4、該公司專利的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數(shù)窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CC

5、D攝影機上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。它是一臺能自動灌膠、自動進樣、自動數(shù)據(jù)收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠（POP6）和GeneScan膠（POP4）。這些凝膠顆?？讖骄?，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器

6、運行等軟件。它使用最新的CCD攝影機檢測器，使DNA測序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進行常規(guī)DNA測序外，還可進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫(yī)學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。實驗材料：1、客戶端：測序模板：可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA

7、等。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時取量1μl為宜。A.含待測質(zhì)粒DNA的菌液：細菌繁殖和質(zhì)粒DNA抽提工作交給公司做。B.或已提純的質(zhì)粒DNA：客戶自己完成質(zhì)粒DNA抽提工作。C.或菌落PCR擴增產(chǎn)物：將待測序的DNA片段用PCR擴增出來，作為提交給公司的模板。測序引物：需根據(jù)所要測定的DNA片段設(shè)計正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。本實驗中使用GAPDHPCR擴增引物F2和R2：同實驗3。2、公司端：[1].BigDye

8、測序反應(yīng)試劑盒主要試劑是BigDyeMix，內(nèi)含PE專利四色熒光標記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaqDNApolymeraseFS，反應(yīng)緩沖液等。[2].pGEM-3Zf(+)雙鏈DNA對照模板0.2g/L，試劑盒配套試劑。[3].M13(-21)引