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《dna基因克隆及序列分析,英語翻譯》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、熱和酸應(yīng)力條件下脂環(huán)酸芽孢桿菌Dnak基因克隆和序列分析DNA基因克隆及序列分析。通過兼并PCR基因組擴增獲得了大約1300bp的基因片段，然后子克隆到PMD-18T載體上測序。BLAST基因組數(shù)據(jù)庫搜索表明，此PCR產(chǎn)物的序列共享原核熱休克蛋白70DNAK基因，與來自脂環(huán)酸芽孢桿菌LAA1伴侶蛋白的DNAK基因的同源性是最高的（92%）。通過基因組步移技術(shù)測定DNAK基因（基因組數(shù)據(jù)庫登錄號HQ893543），包含1854bp完整的開放閱讀對話框（ORF），編碼617個氨基酸。推知的氨基酸序列與來自A.acidocaldari
2、usLAA1(86%)的DNAK基因表達的伴侶蛋白的相似性最高，與來自Bacillustusciae,Paenibacillussp.Y412MC10,Thermosinuscarboxydivorans,Brevibacillusbrevis的A.acidocaldarius的相似性分別為83%,77%,76%,75%。沒有檢測到信號肽。預(yù)測分子量是(Mw)是66.2KDa，等電點（pI）是4.82.氨基酸序列比對和主題搜索結(jié)果顯示，在這個基因中有3個域：N末端核苷酸結(jié)合域(NBD,aa1–360)類似于肌動蛋白ATP酶結(jié)構(gòu)域
3、，它包括三個保存位點(-I-D-L-G-T-T-N-S-,-V-F-D-L-G-G-G-T-F-D-V-S-I-L-,和V-I-L-V-G-G-S-T-R-I-P-A-V-Q-E)，它可能與ATP綁定和激活有關(guān)；aa360–517組成C-末端底物結(jié)合域(SBD);aa-484–617組成的C-末端子域，它可能和底物的結(jié)合和釋放有關(guān)。脂環(huán)酸芽孢桿菌在不同的培養(yǎng)溫度下DNAK基因的表達。脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的溫度范圍從20°C-60°C，最適生長溫度為45-50°C。在這項研究中，脂環(huán)酸芽孢桿菌DSM3922T在45°C中活躍培養(yǎng)16
4、小時，分別在20°C,25°C,30°C,35°C,40°C,45°C,50°C,55°C和60°C繁殖生長。根據(jù)觀察脂環(huán)酸芽孢桿菌在溫度為30°C,35°C,40°C,45°C,50°C和55°C正常生長。在55°C和30°C生長時，分別繁殖8小時和10小時時達到對數(shù)生長期。然而，在培養(yǎng)溫度為20°C，25°C或者60°C時，芽孢生長及其緩慢，與其他處理組像比較很難進入指數(shù)生長期。值的注意的是，在繁殖溫度為20°C，25°C和60°C時沒法收集到足夠的細菌ＲＮＡ用于分離和表達分析。如圖２所示，ＤｎａＫ在培養(yǎng)溫度為30°C,35
5、°C,40°C,45°C,50°C和55°C的基本表達情況。在脂環(huán)酸芽孢桿菌最適生長溫度(40–55°C),其表達水平相對穩(wěn)定。在較低的溫度下，30°C和35°C,Ｄｎａｋ的表達大幅升高。這表明Ｄｎａｋ可能參與脂環(huán)酸芽孢桿菌對不良環(huán)境的適應(yīng)。在熱應(yīng)力條件下脂環(huán)酸芽孢桿菌DNAK的表達。在實驗中，熱應(yīng)力加在45°C繁殖生長到指數(shù)生長期搖瓶菌懸液內(nèi)的細菌上，然后置于溫度分別為70°C,80°C,90°C的恒溫浴內(nèi)。在80°C和90°C時，開始10分鐘內(nèi)，細菌正常生長，15分鐘后細胞開始破裂。隨著熱應(yīng)力的繼續(xù)，有明顯的細胞裂解和細胞凋
6、亡的進一步加劇。在80°C,和90°C時僅僅熱應(yīng)力持續(xù)5分鐘和10分鐘，提取的RNA適合做進一步分析，熱沖擊15分鐘或更長時間，提取的RNA嚴重退化，不能用于ＲＴ－ＰＣＲ分析。當孵育溫度70°C熱沖擊，所有的時間范圍內(nèi)細菌維持正常生長，全部的RNA被分離用于ＲＴ－ＰＣＲ檢測。正如圖３所示，以70°C的熱沖擊溫度，與對照在不孵育的脂環(huán)酸芽孢桿菌相比，ＤＮＡＫ的表達水平在孵育５分鐘增加了４０％，長時間的熱沖擊，表達水平下降，與對照的相比２５分鐘孵育的細菌ＤＮＡＫ表達水平提高了３０％，當熱休克在80°C和90°C時，與對照相比，在5分
7、鐘內(nèi)細菌的DNAK表達水平高速增加70%和15%。有人指出，隨著熱沖擊溫度的上升，DNAK表達水平上升，這顯示了脂環(huán)酸芽孢桿菌對耐熱性可能與DNAK有關(guān)。酸性條件下脂環(huán)酸芽孢桿菌DNAK基因的表達。正如圖所示，在酸脅迫條件下，Dnak的表達水平在1小時內(nèi)迅速增加，直到5小時大幅下降。DnaK的表達水平高于開始在酸脅迫條件下（對照組），在半小時和一小時內(nèi)表達為對照組的2.5倍和3.3倍。隨著酸脅迫的繼續(xù)，Dnak的表達水平在2小時內(nèi)下降到40%，在3小時時為對照組最小量的8%，這表明，Dnak基因可能調(diào)節(jié)脂環(huán)酸芽孢桿菌的的耐酸性。
8、討論Hsp70是已知的進化上最保守的蛋白質(zhì)。包括Dnak，Hsc66，Hsc62。熱休克蛋白70家族被發(fā)現(xiàn)在原核生物體內(nèi),Dnak被廣泛的分析。作為一個組成型的伴侶蛋白，可以上調(diào)熱休克在高溫條件下，他對蛋白質(zhì)的折疊和細胞存活，生長至關(guān)重要。像其熱休克蛋白70家族
