桃兒七內(nèi)生真菌的分離及其活性產(chǎn)物的初步研究

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1、從本學科出發(fā)，應著重選對國民經(jīng)濟具有一定實用價值和理論意義的課題。課題具有先進性，便于研究生提出新見解，特別是博士生必須有創(chuàng)新性的成果桃兒七內(nèi)生真菌的分離及其活性產(chǎn)物的初步研究［摘要］目的從藥用植物桃兒七中分離的內(nèi)生真菌中篩選出能產(chǎn)生木脂素類化合物的菌株。方法用常規(guī)微生物學方法從桃兒七植株中分離出其內(nèi)生真菌，分別對各菌株的提取物進行薄層層析，通過在紫外檢測儀下觀察和用濃硫酸-乙醇顯色定性。結果從桃兒七根、莖中共分離出21株內(nèi)生真菌，其中編號為T8的菌株的菌絲體和發(fā)酵液提取物經(jīng)TLC分析，都出現(xiàn)了與標準品顏色和Rf值相同的斑點。結論該菌株應該

2、具有產(chǎn)生鬼臼毒素或其類似木脂素類化合物的能力。　?。坳P鍵詞］桃兒七；內(nèi)生真菌；鬼臼毒素；木脂素；藥用植物　　藥用植物桃兒七是我國一級保護植物［1］，其主要藥用成分是以鬼臼毒素為代表的木脂素類化合物，具有顯著的抗腫瘤活性以及治療尖銳濕疣和抑菌等作用［2～4］。近年來對鬼臼毒素類藥品的市場需求量劇增。但由于桃兒七種群分布區(qū)域有限，生長較為緩慢，且植物體內(nèi)有效成分含量較低，加之人類的大量采挖，野生資源已經(jīng)處于瀕危狀態(tài)。因此，僅靠從天然植物中提取有效成分已很難滿足市場需求。課題份量和難易程度要恰當，博士生能在二年內(nèi)作出結果，碩士生能在一年內(nèi)作出結果

3、，特別是對實驗條件等要有恰當?shù)墓烙嫛谋緦W科出發(fā)，應著重選對國民經(jīng)濟具有一定實用價值和理論意義的課題。課題具有先進性，便于研究生提出新見解，特別是博士生必須有創(chuàng)新性的成果　　由于內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)普遍存在，而且某些內(nèi)生真菌能產(chǎn)生和其宿主植物相同或相似的活性物質［5，6］，因此，如果能從桃兒七植株中分離并篩選出可以產(chǎn)生鬼臼類木脂素的內(nèi)生真菌，就有可能利用工業(yè)化發(fā)酵方法生產(chǎn)。這樣不僅可以開發(fā)該類植物藥生產(chǎn)的新途徑，改善市場供應，也對保護這種珍貴的植物資源和生態(tài)環(huán)境具有重要意義。1材料與方法實驗材料桃兒七植株采自陜西省太白山自然保護區(qū)。標準品鬼臼

4、毒素購自西安潤德公司。培養(yǎng)基馬丁培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基均按的配方配制［7］。內(nèi)生真菌的分離和純化將植物樣品按常規(guī)方法消毒后，在無菌條件下分別將其根、莖切成約長的小段，接種于馬丁平板上，置2℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。材料邊緣長出菌絲后，按常規(guī)微生物學方法分離，純化后編號并轉接到PDA斜面上保存。搖瓶培養(yǎng)刮取PDA平板上生長的各菌株的菌絲體制成懸液，等量接種于裝有50ml馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，置每分鐘振蕩110次左右的往復式搖床上培養(yǎng)，溫度2℃。課題份量和難易程度要恰當，博士生能在二年內(nèi)作出結果，碩士生能在

5、一年內(nèi)作出結果，特別是對實驗條件等要有恰當?shù)墓烙?。從本學科出發(fā)，應著重選對國民經(jīng)濟具有一定實用價值和理論意義的課題。課題具有先進性，便于研究生提出新見解，特別是博士生必須有創(chuàng)新性的成果　　從接種后的第2天開始，每天取3瓶培養(yǎng)物，用已預先稱重的濾紙抽濾，濾液備用；濾出的菌絲體在60℃烘箱中烘至恒重，冷卻后用天平稱重，繪制生長曲線并分別對其中的活性成分進行初步的定性檢測。菌絲體和培養(yǎng)液中活性成分的檢測將搖瓶灌養(yǎng)中所得的干菌絲體冷凍后研碎并用80%乙醇回流、過濾、濃縮后再加氯仿萃取；發(fā)酵液濃縮后也用氯仿萃取。二者的氯仿萃取液濃縮后，分別點樣于加有

6、3%CMC的硅膠G薄板上進行薄層層析。展開劑為氯仿∶甲醇；顯色劑為濃硫酸-乙醇，顯色條件為120℃，min［8］。2實驗結果與討論.1內(nèi)生真菌的分離及初步薄層分析從桃兒七根、莖中共分離得到21株真菌。經(jīng)分別培養(yǎng)和初步的TLC分析，有3種真菌的菌絲體提取物與鬼臼毒素標準品的Rf值基本相同，而且編號為T8的菌株發(fā)酵液提取物也出現(xiàn)了與標準品相同Rf值的斑點，說明該菌種不僅可能產(chǎn)鬼臼毒素或類似的代謝產(chǎn)物，而且在胞內(nèi)外均有產(chǎn)生。因此，進一步的工作以T8為材料進行擴大培養(yǎng)，合并菌絲體和發(fā)酵液的氯仿提取物再進行TLC分析。.2T8菌株提取物的薄層層析課題

7、份量和難易程度要恰當，博士生能在二年內(nèi)作出結果，碩士生能在一年內(nèi)作出結果，特別是對實驗條件等要有恰當?shù)墓烙?。從本學科出發(fā)，應著重選對國民經(jīng)濟具有一定實用價值和理論意義的課題。課題具有先進性，便于研究生提出新見解，特別是博士生必須有創(chuàng)新性的成果T8樣品的提取物濃縮液經(jīng)薄層展開后，晾干，置于紫外檢測器下觀察可見2個熒光斑點。再用濃硫酸-乙醇顯色后，其中遷移速度較快的斑點呈紫紅色，且與標準品的Rf值相同，再次證明該菌株具有產(chǎn)生和其宿主相同的鬼臼毒素或其類似物的能力。另一遷移較慢的斑點為黃棕色，其性質還有待進一步研究。圖1T8菌株提取物的薄層層析結

8、果　略　　目前國內(nèi)外已有一些從不同產(chǎn)地和不同植物中分離的內(nèi)生真菌中篩選出能產(chǎn)生鬼臼毒素和其他藥用活性成分菌株的報道［5，6］，例如從桃兒七［8］、川八角蓮［9］和南方山荷葉［10