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《檸檬酸產(chǎn)生菌黑曲霉的篩選》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在教育資源-天天文庫。
1、微生物上游技術綜合實驗報告書（2013‐2014學年）實驗題目：檸檬酸產(chǎn)生菌黑曲霉的篩選學院名稱：生物與化學工程學院檸檬酸產(chǎn)生菌黑曲霉的篩選前言：檸檬酸(也稱構椽酸)是重要的有機酸,是檸檬、袖子、柑橘、葡萄等水果天然酸味的主要成分。天然檸檬酸在自然界中分布很廣，天然的檸檬酸存在于植物如檸檬、柑橘、菠蘿等果實和動物的骨骼、肌肉、血液中。 檸檬酸行業(yè)是我國生物農(nóng)業(yè)中的一個重要行業(yè)，廣泛用于食品、醫(yī)藥、生物工程、精細化工等行業(yè)，具有極其廣闊的發(fā)展前景，而黑曲霉是生產(chǎn)檸檬酸最為重要的菌種，它的產(chǎn)酸能力將直接影響檸檬酸的產(chǎn)量，因此黑曲霉的選育將
2、會產(chǎn)生極大的經(jīng)濟效益。檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)目前所采用的菌種主要是黑曲霉菌種和酵母菌菌種，而淀粉質原料發(fā)酵主要以黑曲霉菌種為主。對于檸檬酸發(fā)酵行業(yè)來說，菌種產(chǎn)酸水平的高低是決定檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)的關鍵因素之一，因此，檸檬酸菌種黑曲霉的選育研究一直成為科研人員關注的焦點，國內外有很多關于檸檬酸發(fā)酵菌種黑曲霉選育的研究報道。我國檸檬酸生產(chǎn)菌種的發(fā)酵水平經(jīng)過幾十年的努力，工業(yè)產(chǎn)酸水平平均達到13%以上，盡管我國檸檬酸發(fā)酵技術在世界上暫時處于領先地位，但菌種選育方面的競爭依然形勢嚴峻。因此，應當加快產(chǎn)檸檬酸產(chǎn)生菌的研究，繼續(xù)篩選高產(chǎn)檸檬酸的優(yōu)良菌株，擴大
3、產(chǎn)檸檬酸菌種的來源。本實驗主要進行了土壤中檸檬酸高產(chǎn)菌株黑曲霉的篩選、形態(tài)、產(chǎn)酶條件及酶學性質的研究。 黑曲霉（Aspergillusniger）的形態(tài)特征和生理特征。在固體培養(yǎng)基上，菌落由白色逐漸變至棕色。孢子區(qū)域為黑色，菌落呈絨毛狀，邊緣不整齊。菌絲有隔膜和分枝，是多細胞的菌絲體，無色或有色，有足細胞，頂囊生成一層或兩層小梗，小梗頂端生成串分生孢子。黑曲霉生產(chǎn)菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麥芽糖、糊精、乳糖等培養(yǎng)基上生長、產(chǎn)酸。黑曲霉生長最適pH值因菌種而異，一般pH值為3～7；產(chǎn)酸最適pH值為1.8～2.5。生長最
4、適（optimum）溫度為33～36℃，產(chǎn)酸最適溫度在28～36℃，溫度過高易形成雜酸，斜面培養(yǎng)要求在35°Be左右的麥芽汁培養(yǎng)基上。黑曲霉以無性生殖的形式繁殖，具有多種活力較強的酶系，能力用淀粉類物質，并且對蛋白質、單寧、纖維素、果膠等具有一定的分解能力。黑曲霉可以邊長菌、邊糖化、邊發(fā)酵產(chǎn)酸的方式生產(chǎn)檸檬酸。1、材料與方法1.1材料1.1.1土樣肥沃花壇土、草坪土、菜園土、果園土各一份1.1.2培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基（察式培養(yǎng)基）???蔗糖30gNaNO3??2gMgSO4·7H2O?0.5gKH2PO4?1g?KCl0.5g?FeSO4
5、·7H2O?0.01g溴甲酚綠0.4g??瓊脂20g??蒸餾水1000ml???PH自然分離培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）馬鈴薯300g葡萄糖20g瓊脂20g蒸餾水1000ml自然PH發(fā)酵培養(yǎng)基（玉米粉發(fā)酵與糖蜜發(fā)酵）玉米粉300gɑ－淀粉酶10g蒸餾水1000ml蔗糖150g甲醇30ml1.1.3儀器名稱型號備注生化恒溫培養(yǎng)箱SPX－250B－Z型上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠高壓滅菌鍋YXQ.SG41.280上海醫(yī)用核子儀器廠振蕩搖床ZHWY－2102C上海躍進醫(yī)療器械臺式離心機TGL－16上海醫(yī)療器械三場1.2試驗方法1.2.1土樣采集
6、選取采集地點地表植被根系周圍的土壤，先除去地表浮土及植被根系，然后挖取深約5cm的土壤樣品，裝入滅菌牛皮紙袋中，4℃冰箱中保存。將土樣混合均勻，4℃冰箱保存。1.2.3菌株分離(平板分離法)土樣稀釋：取混合土樣10g裝入90ml無菌水的三角燒瓶中。按常規(guī)稀釋法稀釋土樣。保留10－2，10－3，10－4的土壤稀釋液待用。涂布與培養(yǎng):取10-1，10-2，10-3稀釋液分別涂布于平板培養(yǎng)基上，每個濃度涂布3個培養(yǎng)皿。33℃恒溫箱倒置培養(yǎng)3－4d。觀察與保存:培養(yǎng)3－4d后，挑選菌落形態(tài)、顏色不一致的菌落保存待用。1.2.4篩選采用平板劃線
7、法將保存的單菌落劃線于分離培養(yǎng)基上。33℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3－4d.。通過觀察變色圈的大小初步判斷菌株產(chǎn)酶能力的高低。然后用直尺測出菌落與變色圈直徑，根據(jù)平板上變色圈直徑和菌落直徑的比值(C/H)，選出比值較大的菌株。1.2.5復篩將初篩得到的3種菌株(R1，R2，R3)分別接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)4－6d。取發(fā)酵液離心后即得粗酶液，用細針頭注射器取1ml發(fā)酵液用NaoH溶液滴定，然后測定產(chǎn)酸量與計算產(chǎn)酸率。2、實驗設計方案以生化學院周圍土壤為原材料進行檸檬酸產(chǎn)生菌黑曲霉的篩選與分離。分離得到的黑曲霉作為出發(fā)菌株，并初步對其進
8、行形態(tài)鑒定。利用變色圈法進行初步篩選，以產(chǎn)酸能力的強弱作為復篩指標。以了解和掌握檸檬酸發(fā)酵菌種黑曲霉的菌種特性和分離方法及初步掌握菌種篩選方法設計為目的篩選出一株產(chǎn)酸能力較強的黑曲霉菌株。3、結果與分析3.1黑曲霉的初步
