熒光偏振分析方法

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1、第6章熒光偏振分析方法傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述1納米增強熒光偏振一般策略及應用2§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述光的偏振性非偏振光原理圖偏振光原理圖自然光在各個方向振動是均勻分布的一束光線都在同一方向上振動熒光偏振（FluorescencePolarization，F(xiàn)P）Polarizedexcitation100%0%<100%>0%1926年P(guān)errin首次在研究論文中描述他所觀察到的熒光偏振現(xiàn)象。如果被激發(fā)的熒光物質(zhì)處于靜止狀態(tài)，該物質(zhì)仍將保持原有激發(fā)光的偏振性；如果被激發(fā)的熒光物質(zhì)處于運動狀態(tài)，該物質(zhì)發(fā)出的偏振光將區(qū)別于原有激發(fā)光的偏振特性，也就是所謂的熒光去偏振現(xiàn)象。

2、§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述如何衡量：偏振值的定義P=-+偏振值一般以mP（毫偏）來表示r=-+2對于完全偏振發(fā)射，P=r=1；對于自然光，P=r=0§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述偏振值的影響參數(shù)偏振值衡量熒光分子的運動性§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述分子的偏振性與分子旋轉(zhuǎn)弛豫時間成比例，分子旋轉(zhuǎn)弛豫時間是分子轉(zhuǎn)過68.5度角時所用的時間；分子旋轉(zhuǎn)弛豫時間與介質(zhì)黏度、絕對溫度、分子體積和分子重量和氣體常數(shù)有關(guān)。20世紀50年代Weber進一步拓展了熒光偏振理論并首次將熒光偏振用于生化分析領(lǐng)域。20世紀80年代，隨著熒光探針和熒光偏振分析儀器商業(yè)化，熒光偏振技術(shù)在生

3、命科學等各個領(lǐng)域扮演越來越重要的角色。§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述熒光偏振分析的一般步驟利用熒光偏振的原理，通過檢測熒光素標記的小分子與其它分子相互作用前后分子量的變化，計算水平方向及垂直方向的熒光值作相關(guān)分析。如果被檢測分子大，激發(fā)時運動慢，測得的熒光偏振光值高。如果分子小，分子旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)速度快，發(fā)射光相對于激發(fā)光平面將去偏振化，測得的偏振光值低，從而計算出樣品的偏振值（偏振值單位mP）。通過專用分析軟件，可對檢測結(jié)果進行分析，判別等工作。熒光偏振技術(shù)比研究蛋白質(zhì)與核酸結(jié)合的傳統(tǒng)方法具有更多優(yōu)勢(特別是不生成有害的放射性廢物)并且檢測限更低

4、，可達亞納摩爾級范圍。此外熒光偏振是真正均相的，允許實時檢測(動力學檢測)，對于濃度變化不敏感，是均相檢測形式(中間不含洗滌步驟)的最佳解決方案。熒光偏振技術(shù)的優(yōu)勢:§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述常用的測試儀器及配件國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述1.熒光偏振免疫分析熒光偏振免疫分析法(fluorescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA)是一種定量免疫分析技術(shù)。熒光偏振免疫分析原理§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述1.熒光偏振免疫分析近年來，F(xiàn)PIA備受生物、化學、醫(yī)學專家們的親睞，有關(guān)FPIA在臨床化學、農(nóng)藥殘留

5、分析、食品安全、環(huán)境監(jiān)測中應用的報道逐年增加，成為生化分析和環(huán)境監(jiān)測中強有力的工具。優(yōu)點：均相分析無需分離、迅速、靈敏、無放射性污染、重現(xiàn)性高；缺點：FPIA不如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)靈敏，且熒光標記物可能會與樣本中的基質(zhì)特異性結(jié)合，使熒光偏振值增加，產(chǎn)生一定干擾?！?.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述蛋白質(zhì)與核酸的相互作用是許多生命活動的重要部分，因此成為分子生物學研究的一個熱點熒光偏振技術(shù)為研究蛋白質(zhì)-核酸相互作用提供了一個免分離、免放射性的途徑§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述2.蛋白質(zhì)-核酸相互作用2.蛋白質(zhì)-核酸相互作用核酸適配體(aptamer)是通過SELEX技術(shù)

6、篩選得到的能與蛋白質(zhì)、小分子、金屬離子等靶標結(jié)合的寡核苷酸序列，由于其易合成和修飾、穩(wěn)定性好、成本低，已廣泛應用于分析應用領(lǐng)域傳統(tǒng)分子量依賴性FA用于研究蛋白質(zhì)-核酸相互作用的原理Biosens.Bioelectron.2012,32,148-154.§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述3.核酸分析Chem.Commun.2011,47,3478-3480.改進傳統(tǒng)的熒光偏振檢測方法，通過引入酶促反應擴增檢測信號應用于超靈敏檢測特異性DNA的檢測。超靈敏檢測DNA§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述3.核酸分析NucleicAcidsRes.2003,31:e70.實時監(jiān)測DNA雙鏈的

7、形成和解鏈過程§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述4.水解酶催化反應Chem.Rev.2010,110,2685-2708.實時監(jiān)測蛋白酶催化過程蛋白酶對機體的新陳代謝和生物調(diào)控起到非常重要的作用；蛋白酶酶活的評估有助于理解特定的生化途徑、開發(fā)治療藥物。§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概述Anal.Chem.2009,81,7468-7473.非競爭法檢測小分子化合物5.小分子分析§6.1傳統(tǒng)熒光偏振技術(shù)及發(fā)展情況概