熒光偏振免疫分析.ppt

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1、熒光偏振免疫分析---by沈未熒光偏振(fluorescencepolarization,FP)通常定義為:用垂直方向(丄)的偏振光激發(fā)熒光分子,然后測(cè)量發(fā)射偏振光在垂直方向(丄)和水平方向(丨)的熒光光強(qiáng)度(丨)早期的熒光偏振研究均以P表示,目前其仍常用于臨床化學(xué)和藥物篩選;而A多生物學(xué)檢測(cè),是因其便于進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和解釋某些相關(guān)的物理學(xué)參數(shù)。FP值是一個(gè)比值,一般以mP表示(1P=1000mP)。分子固定不動(dòng),即完全偏振時(shí),FP值是P0=1000mP,是理論上的最大值;在一個(gè)分子可以自由運(yùn)動(dòng)的系統(tǒng)中,根據(jù)分子運(yùn)動(dòng)速度的快慢,熒光偏振值大約在

2、0~500mP之間.論文的結(jié)構(gòu)和主要內(nèi)容如果待測(cè)樣本中競(jìng)爭(zhēng)抗原含量很少(低于檢測(cè)限),熒光標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合,FP值較高(一般在150-300mP)。而待測(cè)樣本中競(jìng)爭(zhēng)抗原的濃度增加時(shí),熒光標(biāo)記抗原以游離的形式存在于樣本中,FP值便會(huì)下降,一般在30-60mP即為完全抑制FPIA是均相的競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法,反應(yīng)完全在溶液系統(tǒng)中,不需要分離結(jié)合的和未結(jié)合的抗體。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程非常簡(jiǎn)單,僅僅是將抗體,熒光標(biāo)記的抗原和抗原加入到反應(yīng)杯中,經(jīng)過(guò)幾分鐘甚至是幾秒鐘的溫育便可直接測(cè)量,很快得到被測(cè)抗原的濃度。組蛋白對(duì)DNA熒光偏振度影響1.制備DNA-組蛋白復(fù)

3、合體:λ-DNA(48kbp)用熒光染料YOYO-1標(biāo)記,堿基對(duì)與染料分子之比為10:1;用Bis-Tris緩沖液(50mmol/L,pH≈6.6)稀釋組蛋白溶液;組蛋白濃度是DNA的10~500倍;DNA/YOYO-1溶液(6.5pmol/L)和稀釋后的組蛋白溶液共同保溫(37℃)培育3h,反應(yīng)液體積為2mL;組蛋白對(duì)DNA熒光偏振度影響2.熒光偏振度測(cè)量:用MOS-450/CD測(cè)量,其是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的熒光偏振度測(cè)量模式;在測(cè)量熒光偏振度時(shí),偏振光彈性調(diào)制器自動(dòng)設(shè)置在半波長(zhǎng)模式,這樣激發(fā)光在水平分量和垂直分量之間以100kHz的頻率轉(zhuǎn)換;應(yīng)用B

4、io-Kine軟件(Bio-Logic)通過(guò)兩個(gè)散射信號(hào)實(shí)時(shí)計(jì)算熒光強(qiáng)度和熒光偏振度;組蛋白對(duì)DNA熒光偏振度影響3.DNA-組蛋白復(fù)合體熒光偏振度隨組蛋白與DNA濃度比變化關(guān)系曲線組蛋白對(duì)DNA熒光偏振度影響4.對(duì)圖表的解釋:在溶液中單獨(dú)存在時(shí),DNA分子隨機(jī)卷曲且有彈性此構(gòu)型對(duì)應(yīng)著一定的偏振度值.在我們的實(shí)驗(yàn)條件下,DNA分子的熒光偏振度在0.11左右;在組蛋白的作用下，DNA分子發(fā)生了凝聚;DNA-組蛋白分子可能呈現(xiàn)更緊密、更小的構(gòu)型,導(dǎo)致復(fù)合體分子比DNA分子旋轉(zhuǎn)更快,對(duì)應(yīng)較小的熒光偏振度值;熒光偏振研究的一般步驟1.確定最佳的熒光標(biāo)

5、記物;2.確定公式中的各種參數(shù);3.倍比稀釋結(jié)合物，根據(jù)不同的FP值確定最優(yōu)稀釋比，使其結(jié)合能力與FP值成線性關(guān)系;4.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;5.分析結(jié)果,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)猜想。熒光偏振免疫分析的優(yōu)點(diǎn)1.均相系統(tǒng),不需要洗滌操作,可大大減少試劑的用量。2.檢測(cè)速度很快,且易于自動(dòng)化,適于快速的篩選檢測(cè)。3.熒光標(biāo)記抗原的均一性好,性質(zhì)穩(wěn)定,可長(zhǎng)期保存,方法的重現(xiàn)性好。4.FP值是一個(gè)比值,與其他熒光檢測(cè)技術(shù)相比,不易受溶液顏色和儀器靈敏度變化的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定,可靠性高。5.選用不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光素來(lái)進(jìn)行多標(biāo)記檢測(cè),可實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物的同時(shí)定性及定量分析。如四

6、甲基羅丹明,其激發(fā)和發(fā)射光譜與熒光素的重疊很少,因此相互之間基本不會(huì)干擾,現(xiàn)已在多標(biāo)記檢測(cè)中得到應(yīng)用。熒光偏振免疫分析的缺點(diǎn)1.FPIA比ELISA方法的靈敏度低。一般來(lái)說(shuō)FPIA的檢測(cè)限為0.1-10ng/mL-1左右。2.FPIA易受樣本基質(zhì)(如與基質(zhì)蛋白的非特異性結(jié)合),背景熒光和光散射的影響。3.FPIA的檢測(cè)信號(hào)的背景較高,檢測(cè)范圍(窗口)較窄,信噪比(S/N)較低。4.FPIA對(duì)熒光標(biāo)記物的純度要求較高,需耍較復(fù)雜的純化步驟。5.FPIA檢測(cè)需要特定的分析儀器,或?qū)ζ胀ǖ臒晒夥止夤舛扔?jì)增加測(cè)量偏振附件。因此價(jià)格較普通酶標(biāo)儀昂貴。對(duì)

7、本實(shí)驗(yàn)室研究的思考當(dāng)研究對(duì)象為與核酸(DNA/RNA)互作的蛋白時(shí)，可以在核酸的末端加上一個(gè)熒光標(biāo)簽,研究二者之間的結(jié)合關(guān)系,包括結(jié)合常數(shù),動(dòng)力學(xué)參數(shù)等等。推而廣之，還通過(guò)核酸等小分子研究蛋白-蛋白復(fù)合物之間的結(jié)合。