精液冷凍概述課件

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1、精液冷凍技術(shù)概述四川大學(xué)華西第二醫(yī)院人類精子庫(kù)2精液冷凍歷史回顧1776年Spallanzani偶然發(fā)現(xiàn)將人精液埋藏于冰雪仍可存活1886年Mantegazza發(fā)現(xiàn)在－15℃下的精子可以存活較長(zhǎng)時(shí)間；1937年Jannel報(bào)告人類精子可在-196℃中存活；1949年P(guān)olge首先發(fā)現(xiàn)甘油對(duì)冷凍精子具有特殊保護(hù)作用。3冷凍精液的臨床意義供者人工授精（AID）使用方便，并且可以配合女性生殖周期進(jìn)行；對(duì)有先天遺傳疾病和嚴(yán)重傳染性疾病的患者可以使用；進(jìn)行生殖保險(xiǎn)；如男性絕育手術(shù)者，腫瘤患者化療前，從事危險(xiǎn)行業(yè)者等；對(duì)于少、弱精癥者，可多次采集冷凍后加以濃縮；對(duì)于取精困難和梗阻性無(wú)精癥的患者在ICSI

2、治療時(shí)，用凍融精子代替新鮮精子可避免反復(fù)抽吸睪丸或附睪，利于醫(yī)患雙方掌握治療進(jìn)度。4冷凍損傷原理冰晶損傷學(xué)說icecrystaldamage溶液效應(yīng)學(xué)說solutedamage5冷凍原理降溫過程分期：溫度休克期RT~5℃潛熱擴(kuò)散期5～0℃冰晶形成期0～－15℃再結(jié)晶期－15～－79℃保存期－80～－196℃6冷凍損傷原理精子示意圖：精子細(xì)胞外冰晶形成胞內(nèi)冰晶形成細(xì)胞脫水冰晶損傷溶液損傷降溫快速慢速7冷凍對(duì)精子產(chǎn)生的損傷超微結(jié)構(gòu)的損傷：冷凍復(fù)溫后的精子外膜變薄，波浪狀改變或破損，胞漿、頂體內(nèi)和線粒體內(nèi)透光度增加，頂體增寬，線粒體外形變圓，軸絲增粗，提示細(xì)胞腫脹是形態(tài)改變得主要征象。精子功能：日

3、本學(xué)者研究根據(jù)精子頂體功能和穿透率無(wú)顯著變化，發(fā)現(xiàn)冷凍精子授精能力無(wú)下降。染色體：目前對(duì)冷凍保存精子染色體自然畸變率報(bào)道不多，仍存在爭(zhēng)論8冷凍保護(hù)原理冷凍保護(hù)液滲透性增加細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，降低細(xì)胞內(nèi)外液的冰點(diǎn)，減少冰晶的形成。非滲透性調(diào)節(jié)PH，細(xì)胞外滲透壓，增加營(yíng)養(yǎng)不同溫區(qū)最適的冷凍速率研究表明過快或過慢的降溫都是不合適的，應(yīng)根據(jù)不同的冷凍保護(hù)劑選擇各個(gè)溫區(qū)最佳的降溫速度。目前還未找到。9冷凍保護(hù)劑（CPM）根據(jù)CPM的特性：非滲透性CPM：卵黃、葡萄糖、蔗糖滲透性CPM：甘油根據(jù)CPM種類:單一甘油型復(fù)合甘油型無(wú)甘油型10冷凍保護(hù)劑（CPM）各成分的主要作用:甘油：有滲透性，當(dāng)進(jìn)入精子細(xì)胞

4、內(nèi)時(shí)使精子內(nèi)的含水蛋白質(zhì)穩(wěn)定，降低細(xì)胞內(nèi)液冰點(diǎn)，減少冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。但甘油本身對(duì)細(xì)胞也有一定的毒性，一般終濃度控制在7～10％。卵黃：提高細(xì)胞外滲透壓，含有卵磷脂，可以穩(wěn)定精子的細(xì)胞膜，防止頂體外膜破裂。它的缺點(diǎn)是凍融后有大量的顆粒和碎片，并且有病毒感染和過敏反應(yīng)當(dāng)可能。11冷凍保護(hù)劑（CPM）各成分的主要作用:葡萄糖：與調(diào)節(jié)滲透壓有關(guān)緩沖系統(tǒng)：可以結(jié)合游離的H+和OH－，有助于溶液和精子脫水現(xiàn)在常用CPM:單一甘油型G－Y－C型（甘油－卵黃－檸檬酸鈉型）TEST－G－Y－C（TES－Tris緩沖系統(tǒng)＋GYC）型G－Y－C－G型（GYC＋谷氨酰胺）改良T－G型（改良Tyrode液－甘

5、油型）12冷凍保護(hù)劑（CPM）改良T－G型，它的優(yōu)點(diǎn)有：相比有較好的冷凍復(fù)蘇率（本精子庫(kù)平均62.6％）可準(zhǔn)確配制不含卵黃，消除可能的病毒感染和過敏反應(yīng)背景清晰，無(wú)大量顆粒和碎片儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)，可達(dá)3個(gè)月13降溫程序分類：程序降溫：利用程序降溫儀進(jìn)行精確降溫。手工降溫：利用現(xiàn)有降溫設(shè)備和液氮蒸氣分步驟降溫。注：由于現(xiàn)在還沒有找到降溫過程中各個(gè)溫區(qū)最佳降溫速率，文獻(xiàn)報(bào)道的各種降溫程序精液復(fù)蘇率效果不一！降溫前處理：在室溫中將精液與CPM1:1混勻，通常是在20min逐量加入，且用振蕩器持續(xù)振蕩，轉(zhuǎn)速約300/min。此過程在提高精液復(fù)蘇率中起重要作用之一。14降溫程序程序降溫得到多數(shù)學(xué)者的認(rèn)同，有

6、精確定降溫速率控制，復(fù)蘇率較高。缺點(diǎn)是儀器昂貴，使用和維護(hù)費(fèi)用也較高，不適合普及。15降溫程序手工降溫：25℃（RT下加CPM）—4℃-20min—LV（LN上5cm處）-10min—LN25℃（RT下加CPM）—4℃-60min—－20℃-20min—LN25℃（RT下加CPM）—4℃-20min—－20℃-20min—LV（LN上5cm處）-5min—LN25℃（RT下加CPM）—LV（LN上5cm處）-15min—LN16復(fù)溫程序原則：是快凍快復(fù)、慢凍慢復(fù)方法：37℃水浴快速?gòu)?fù)溫復(fù)溫?fù)p傷機(jī)制：Mohammad等連續(xù)觀察精子在冷凍過程中的損傷情況發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的細(xì)胞損傷發(fā)生在復(fù)蘇期。當(dāng)快速

7、降溫時(shí)使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生小冰晶，如果緩慢復(fù)溫，小冰晶將會(huì)融合成大冰晶對(duì)細(xì)胞形成損傷；當(dāng)慢速降溫時(shí)細(xì)胞外的水分首先結(jié)冰，胞外溶質(zhì)濃度升高導(dǎo)致精子細(xì)胞脫水，快速?gòu)?fù)溫使胞外的水分來不及回滲，造成精子的皺縮，形成溶質(zhì)性損傷。17冷凍復(fù)溫后的處理使用精子營(yíng)養(yǎng)液可使復(fù)溫后的精子在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持良好的活動(dòng)率。使用化學(xué)物質(zhì)如：己酮可可堿（PF）、2-脫氧腺苷（2-DA）提高冷凍復(fù)蘇后的精子的活率和活力。18精液研究的新進(jìn)展玻璃化低