豬冷凍精液技術(shù)研究

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1、豬冷凍精液技術(shù)研究夏天'高金鑾'付光棟2姚德成'黃江春''陸肖芬'陳杰"周三華"力長華2（1.海南（羅牛山）養(yǎng)豬研究所海南?？?71126；2.羅牛山畜牧公司海南?？?71126；3.羅牛山人工授精站海南?？?711264.羅牛山新華豬場海南?？?71126）摘要：通過反復(fù)試驗，選擇活力0?7級以上的新鮮公豬精液，過濾后立即用BTS液按1：1稀釋在17°C冰箱中平衡2.5~3h后，用2000g/min,離心8min,去上清液后，用加海藻糖的TCG卵黃液按1：1稀釋，后在0?4°C冰箱中平衡2h,然后按體積加入甘油，甘油最終濃度為3%,再分裝至0.5ml塑料細管中，置于0°C凍箱中平衡lh,在鋁

2、盒中距液氮面3cm處冷凍，結(jié)果表明，經(jīng)液氮儲存的豬精液在52°C水溫下解凍12s,解凍活力在0?3級以上，輸精6頭母豬，共產(chǎn)仔55頭，平均9.16頭，活健仔53頭，平均8.82頭。自1950年英國polge發(fā)明冷凍精液技術(shù)以來，首先在奶牛群中普及，隨后在其它牛屬動物中擴大推廣，其后乂在羊?qū)賱游镏型茝V。但在豬祥的推廣較少見，豬的精液量很大（平均為170ml）且不易冷凍，兒十年來，雖有研究報導(dǎo)，但受胎率低、產(chǎn)仔數(shù)少，應(yīng)用極不普遍。近年來國外種豬公司，雖有少量應(yīng)用，但其價格昂貴不易推廣應(yīng)用，國內(nèi)目前雖有多家院校進行研究，但至今無一家正式應(yīng)用于生產(chǎn)。為了海南種豬事業(yè)的發(fā)展，和便于國家核心育種場交流種豬

3、血統(tǒng)以及地方優(yōu)良豬種特別是瀕危豬種的保護，我們從2008年開始歷時5年，進行了豬冷凍精液技術(shù)的研究，現(xiàn)將研究情況報告如下。1試驗地點與材料1.1試驗時間2008年?2010年4刀1.2試驗地點中科院?？诳茖W(xué)實驗室、羅牛山豬人工授精站實驗室、海南養(yǎng)豬研究所實驗室、羅牛山新華豬場1.3試驗材料液氮、干冰、無水酒精、-80°C低溫冰箱、17°C恒溫冰箱、普通冰箱、相差顯微鏡、顯示器、空調(diào)。BTS稀釋液（口配）、TCG+海藻糖稀釋液（口配）、新鮮雞蛋黃、LT油、0.25ml>0.5ml、2.5ml細管、秒表等。1.4試驗方法正交試驗法、以2?3個評定員憑經(jīng)驗評定凍后活力，記錄按評定的平均值計算，0.3

4、以上活力為合格。隨機挑選母豬作輸精試驗。2試驗內(nèi)容與結(jié)果2.1探索另類冷凍技術(shù)先進行預(yù)備試驗，探索另類冷源。我們利用中科院?？诳茖W(xué)實驗室的-80°C冰箱，將無水酒精預(yù)冷凍到-80°C,將處理好的精液裝入飲料細管中，用聚乙烯醇粉封口，以及裝入生化用的耐凍塑料細管中（直徑10mm蓋上蓋子）浸入已預(yù)冷至于-80°C無水酒精中（酒精的冰點為-112°C）經(jīng)7次試驗見表1：試驗次數(shù)凍后活力飲料細管塑料安瓶1?7次0.000.00由于降溫控制不好，精液密封不嚴，有酒精滲入，試管口徑過大，7次試驗冷凍后活力均為0.00級，但視野中仍有個別直線前進運動的精子。2.2三種冷源的比較為了比較另類冷源與止規(guī)冷源（干

5、冰、液氮）的優(yōu)劣，我們?nèi)杂脽o水酒精。無水酒精是裝入大口試管后在干冰中預(yù)冷到-78°C,所用細管為日本產(chǎn)正規(guī)0.25ml冷凍精液用細管，外面加一個料薄膜套。正交試驗結(jié)果表2：試驗號A：AGE配方中添加B：卄油濃度C：分裝及冷源三人評均活力評分1海藻糖14%3灑精細管0.112氨基乙酸14%1干冰顆粒0.283海藻糖卵黃14%2液氮顆粒0.451海藻糖25.5%2液氮顆粒0.232氨基乙酸25.5%3灑精細管0.003海藻糖卵黃25.5%1干冰顆粒0.281海藻糖37.0%1干冰顆粒0.192氨基乙酸37.0%2液氮顆粒0.163海藻糖卵黃37.0%3灑精細管0.10A10.18B10.28C10

6、.25A20.15B20.17C20.28A30.28B30.15C30.07本次試驗結(jié)果顯示，冷凍液配方的海藻糖+卵黃液為好，三種廿油濃度以4%廿油的低濃度為好。冷源選擇以酒精細管為并，加上在干冰中預(yù)冷的無水酒精不適合大量制作豬精液冷凍，故在后續(xù)試驗中淘汰出局。2.3配方屮海藻糖劑量的優(yōu)選在冷凍保護液中，加入海藻糖是近年新發(fā)現(xiàn)的一項研究成果，我們先后在TCG冷凍保存液中加入1.25%.1.65%兩個劑量，取得了制造合格精液的目標，但也有失敗的記錄,后來又進行了加入3.5g/100mlTCG進行優(yōu)選。在每lOOmlTCG冷凍保護液中分別釆用1.25g、1.65g和3?5g進行比較,制出合格精液

7、的次數(shù)為4/10、6/10、7/10o于是在TCG配方中的加入海澡糖劑量選定為3.5%。2.4甘油濃度的選擇甘油是良好的冷凍保護劑，雖然目前已有兒種替代甘油化學(xué)試劑的報導(dǎo)，但效果都不如甘油。因而目前為止，廿油是家畜冷凍精液必須的保護劑。在牛的冷凍精液生產(chǎn)中,甘油的用量為7%?9%。而在豬的冷凍精液研究屮，甘油既是不可缺少的冷凍保護劑，又傷害精了質(zhì)膜完整性，影響受胎率。因此我們尋求低濃度甘油的試驗見